李正陽， 張劍南， 陳軍安， 李娟， 王亞軍

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065)

鈉尿肽家族(natriuretic peptide system，NPs)是一類重要多肽家族，可參與調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞、神經(jīng)調(diào)節(jié)、免疫和生長等多種生理過程(Toop & Donald，2004)，以及維持機體滲透穩(wěn)態(tài)和心血管穩(wěn)態(tài)。NPs由心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)和C-型鈉尿肽(C-type natriuretic peptide，CNP)3種結(jié)構(gòu)相關(guān)多肽組成(Martinez-Rumayoretal.，2008；Nobataetal.，2010)。ANP和BNP主要在心肌細胞中合成，分泌進入血液循環(huán)發(fā)揮作用；而CNP則作為旁分泌或自分泌因子合成于大腦或其他外周組織，且具有遠弱于ANP和BNP的利尿利鈉作用(Takei，2000)。在哺乳動物中，CNP的生理功能包括調(diào)節(jié)長骨生長、促進軟骨內(nèi)骨化以及作用于血管平滑肌細胞發(fā)揮血管舒張作用等(Potteretal.，2006；Johnson & Olson，2008)；此外，CNP可以作用于垂體細胞，促進胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cGMP)的積累，抑制促性腺激素釋放激素(GnRH)誘導的鈣動員，抑制促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)誘導的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)釋放等(Fowkesetal.，1999；Fowkesetal.，2000；Chatelainetal.，2003)。

NPs的生理功能依賴其特異性鈉尿肽受體(natriuretic peptide receptors，NPRs)發(fā)揮效應(yīng)。在哺乳動物中，NPRs可分為NPR-A、NPR-B和NPR-C 3種類型(Potteretal.，2006)。其中，不同于NPR-A(能夠結(jié)合ANP和BNP)和NPR-C(能夠結(jié)合3種類型的NPs)，NPR-B只能選擇性地結(jié)合CNP，并介導其生理功能，如，CNP或NPR-B敲除型小鼠由于軟骨骨化功能受損，會表現(xiàn)出嚴重的侏儒癥表型(Chushoetal.，2001；Tamuraetal.，2004；Tsuji & Kunieda，2005)。NPR-B為單次跨膜受體，與NPR-A和NPR-C的氨基酸序列同源性分別為44%和30%，其N端的433個氨基酸位于細胞膜外，最初的22個氨基酸為信號肽序列。此外，N端還包含與CNP結(jié)合的重要位點Glu332以及參與形成3對二硫鍵的6個Cys殘基和7個N糖基化位點(Ogawaetal.，2004)。C末端的252個氨基酸為鳥苷酸環(huán)化酶區(qū)域，該區(qū)域被認為具有鳥苷酸環(huán)化酶活性(Beavo & Brunton，2002)，可以通過產(chǎn)生胞內(nèi)第二信使cGMP從而介導CNP的生理效應(yīng)(Pandey，2005；Sabbatinietal.，2005；Kobayashietal.，2012)。

盡管在哺乳動物中，NPR-B的結(jié)構(gòu)及其介導的生理功能已逐步明確，但在禽類中，有關(guān)NPR-B的研究幾屬空白。鑒于NPR-B介導的軟骨骨化和垂體激素釋放等生理功能與經(jīng)濟效益密切相關(guān)，本研究選擇家雞Gallusgallusdomesticus為模型，首次從垂體組織中克隆得到了家雞NPR-B基因，確定其氨基酸序列，在此基礎(chǔ)上，利用實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)首次探究NPR-B基因在成年家雞中的組織表達圖譜。本研究為探究家雞NPR-B的胞內(nèi)信號通路及其在家雞中介導的生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物為羅曼粉成年家雞，購自四川牧星養(yǎng)雞場，共選取成年家雞6只(3雄3雌)；真核表達載體pcDNA3.1(+)購自Invitrogen；引物合成、DNA測序工作由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成；RNAzol購自Molecular Research Center；KOD FX高保真DNA聚合酶購自TOYOBO；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、Easy-Taq酶、限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶均購自TaKaRa；分子克隆宿主大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞由本實驗室制備保存；PCR儀(S1000 Thermal Cycler)、熒光定量PCR儀(CFX96)、熒光染料Eva Green、96孔板、塑料封膜均購自Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1總RNA提取取家雞組織，包括全腦、心臟、腎臟、肝臟、肌肉、卵巢、精巢、十二指腸、垂體、脾臟、脂肪、端腦、中腦、小腦、后腦和下丘腦等，迅速放入液氮并充分研磨成粉末?？俁NA提取嚴格按照說明書操作：取約60 mg組織粉末與600 μL RNAzol混合；補充240 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)滅菌水，用渦旋儀混勻約15 s；4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；取上清，加入3 μL阿司咪唑，渦旋15 s后于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min；取上清，加入等體積異丙醇，于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min；小心吸取上清并棄掉，加入75%乙醇漂洗總RNA沉淀，于4 ℃、8 000 r·min-1離心3 min；重復上一步，漂洗RNA沉淀；棄上清，用20 μL DEPC滅菌水溶解沉淀，及時構(gòu)建cDNA模板或-80 ℃保存。

1.2.2引物設(shè)計利用NCBI預測的家雞NPR-B基因序列(GenBank登錄號：XM_003642919)和家雞的野生祖先紅原雞Gallusgallus基因組數(shù)據(jù)庫信息(http：//www.ensembl.org/Gallus_gallus)，依據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計克隆家雞NPR-B基因的編碼區(qū)全長克隆引物和用于組織表達分析的qPCR引物(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

注： 下劃線表示引物設(shè)計時添加的限制性內(nèi)切酶酶切位點

Note： Restriction sites added at the 5’-end of the primers are underlined

1.2.3cDNA模板制備以各組織總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA模板。取2 μg總RNA樣品，與1 μL Oligo-dT混合；補DEPC滅菌水至總體積5 μL(Oligo-dT終濃度為0.5 μg·μL-1)，混勻；于PCR儀中70 ℃反應(yīng)10 min后，立即取出放置于冰上10 min；加入2 μL5×RT buffer，0.5 μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，0.5 μL dNTPs，補充DEPC滅菌水至總體積10 μL，混勻后于PCR儀中42 ℃反應(yīng)1.5 h，70 ℃反應(yīng)10 min結(jié)束；取反應(yīng)所得產(chǎn)物加入70 μL滅菌水，所得混合溶液即為cDNA模板。

1.2.4載體構(gòu)建以家雞垂體組織cDNA為模板，使用引物對NPR-B基因的開放閱讀框(ORF)進行擴增。PCR擴增體系：5 μL 2×KOD緩沖液，2 μL垂體組織cDNA模板，2 μL dNTPs，上、下游引物各0.1 μL，0.5 μL KOD-FX聚合酶，0.3 μL去離子滅菌水。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸3 min，34個循環(huán)；68 ℃延伸10 min。取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果。利用DNA純化回收試劑盒回收PCR反應(yīng)液，使用EcoRⅠ和HindⅢ對pcDNA3.1質(zhì)粒和純化回收產(chǎn)物進行酶切，37 ℃過夜；純化回收酶切產(chǎn)物，使用T4DNA連接酶連接的pcDNA3.1和NPR-B片段；按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，再涂于含氨芐青霉素、IPTG和X-Gal的LB培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆提取質(zhì)粒，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.5組織表達分析采用家雞不同組織的cDNA模板，3只公雞為雄性組，3只母雞為雌性組，以qPCR方法檢測NPR-B基因的表達水平，具體方法參考祝國強等(2017)和鄧秋洋等(2018)。PCR擴增體系：0.4 μL二甲亞砜，2 μL 10×buffer，6 μL cDNA模板，0.4 μL dNTPs，上、下游引物各0.2 μL，1 μL熒光染料Eva Green，1 μL Easy-Taq酶，最后用去離子滅菌水補足總體積至20 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，39個循環(huán)，按照0.5 ℃/5 s的速度從70 ℃到95 ℃向上升溫熔解，生成熔解曲線。熒光定量PCR的結(jié)果按照比較CT值法(2-ΔΔCT法)進行相對表達量數(shù)據(jù)處理。

1.2.6生物信息學分析使用SnapGene、DNAStar和APE進行序列分析和蛋白質(zhì)翻譯，IBS 1.0繪制基因結(jié)構(gòu)圖，BioEdit和DNAMAN進行DNA和蛋白質(zhì)序列比對，CFX Manager進行qPCR數(shù)據(jù)定量分析；序列分析使用的在線數(shù)據(jù)庫包括GenBank(http：//www.ncbi.nih.gov)、Ensembl(http：//www.ensembl.org)和TMHMM 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析實驗數(shù)據(jù)用Graphpad Prism7進行分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準差(Mean±SD)表示，相同組織在雄性組和雌性組之間的比較用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 家雞NPR-B基因的克隆與序列分析

實驗成功擴增得到與預期大小一致的NPR-B基因條帶(圖1)。將家雞NPR-B基因的測序結(jié)果與紅原雞基因組序列進行比對，結(jié)果顯示：家雞NPR-B基因位于Z染色體上，包含22個外顯子(圖2)，編碼區(qū)cDNA全長3 189 bp，編碼1 062個氨基酸(GenBank登錄號：MH271322)。家雞的NPR-B與人Homosapiens、大鼠Rattusnorvegicus、非洲爪蟾Xenopuslaevis和斑馬魚Daniorerio相比，氨基酸序列一致性分別達到了79%、78%、73%和67%。胞內(nèi)區(qū)(intracellular domain，ICD)存在高度保守的結(jié)構(gòu)域，包括無激酶活性的激酶同源區(qū)(kinase homology domain，KHD)和鳥苷酸環(huán)化酶區(qū)(guanylyl cyclase domain，GCD)，且KHD中存在NPR-A和NPR-B均具有的保守的ATP結(jié)合元件Gly-X-X-X-Gly序列(圖3)。

圖1 家雞NPR-B基因擴增
Fig. 1 PCR amplification ofNPR-Bgene fromGallusgallusdomesticus

圖2 家雞NPR-B基因結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structure of NPR-B gene from Gallus gallus domesticus

方框代表外顯子， 黑色陰影部分代表編碼區(qū)

Boxes indicate exons， black shaded parts indicate the coding regions

圖3 家雞NPR-B的氨基酸序列與人、大鼠、非洲爪蟾和斑馬魚比對Fig. 3 Amino acid sequence alignment of Gallus gallus domesticus NPR-B with that of Homo sapiens， Rattus norvegicus， Xenopus laevis and Danio rerio

方框內(nèi)部分為激酶同源區(qū)， 陰影部分為ATP結(jié)合位點和鳥苷酸環(huán)化酶區(qū)

Boxes indicate the kinase homology domain， shaded areas are ATP binding site and the guanylyl cyclase domain

2.2 家雞NPR-B基因mRNA組織表達分析

在外周組織中，NPR-B基因高表達于心臟、肌肉、腎臟和垂體，而在精巢、十二指腸的表達量相對較低，在脂肪、脾臟檢測到微弱的表達信號；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，NPR-B基因高表達于中腦，在其他腦功能區(qū)的表達水平較低。

NPR-B基因位于家雞Z染色體上，因此，基因組中雄、雌性的NPR-B基因拷貝數(shù)比例為2∶1。比較不同性別組中NPR-B基因的組織表達情況(圖4：A)，結(jié)果顯示，雄性個體NPR-B基因在端腦和小腦中具有更高的表達水平，而雌性個體NPR-B基因在心臟、腎臟和垂體組織中具有更高的表達水平。

NPR-B基因在垂體中具有較高的表達水平，檢測其在垂體頭部和尾部的表達，結(jié)果顯示，NPR-B基因特異性高表達于垂體頭部(圖4：B)。

圖4 家雞NPR-B基因組織表達Fig. 4 Expression of NPR-B gene in the tissues of Gallus gallus domesticus

A. qPCR檢測NPR-B基因mRNA在家雞各組織中的表達(以β-actin基因作為內(nèi)參，n=3)， Br. 全腦， He. 心臟， Ki. 腎臟， Li. 肝臟， Mu. 肌肉， Ov. 卵巢， Te. 精巢， Du. 十二指腸， Pi. 垂體， Sp. 脾臟， Fat. 脂肪， Tc. 端腦， Mb. 中腦， Cb. 小腦， Hb. 后腦， Hp. 下丘腦； B. qPCR檢測NPR-B基因在家雞垂體頭部(Ce)和尾部(Ca)的分布情況(以β-actin基因作為內(nèi)參，n=6)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

A. Expression ofNPR-Bgene in chicken tissues as determined by qPCR (the mRNA levels ofNPR-Bwere normalized to those ofβ-actin，n=3)， Br. whole brain， He. heart， Ki. kidney， Li. liver， Mu. muscle， Ov. ovary， Te. testis， Du. duodenum， Pi. pituitary， Sp. spleen， Fat. fat， Tc. telencephalon， Mb. midbrain， Cb. cerebellum， Hb. hindbrain， Hp. hypothalamus； B. qPCR detection ofNPR-BmRNA distribution in cephalic lobe (Ce) and caudal lobe (Ca) of chicken pituitary (the mRNA levels ofNPR-Bwere normalized to those ofβ-actin，n=6)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

在哺乳動物中，CNP作為旁分泌或自分泌因子，通過激活NPR-B參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能、血管張力、成骨細胞分裂分化以及軟骨骨化等功能(Potteretal.，2006)，但其在禽類中的研究十分欠缺。本研究從家雞垂體組織中克隆得到NPR-B基因，并首次報道其序列和組織表達圖譜，研究結(jié)果為探究NPR-B受體及其配體CNP在家雞中的生理功能奠定基礎(chǔ)。

家雞NPR-B基因的cDNA序列全長3 189 bp，由22個外顯子組成，編碼具1 062個氨基酸的蛋白。氨基酸序列比對顯示，家雞NPR-B與人、大鼠、非洲爪蟾和斑馬魚均具有較高的序列一致性，尤其是ICD的氨基酸序列高度保守，該區(qū)域包含的位點有助于NPR-B二聚化及結(jié)合配體后的空間構(gòu)象改變。在受體激活后，ATP將結(jié)合到胞內(nèi)KHD上的ATP結(jié)合位點，活化的KHD進一步激活下方的鳥苷酸環(huán)化酶，從而催化胞內(nèi)cGMP的生成(Joubertetal.，2005)，這預示著NPR-B在家雞中具有與哺乳動物類似的信號通路。

本研究利用qPCR解析NPR-B基因在家雞組織中的表達。結(jié)果顯示，NPR-B基因在家雞心臟、腎臟、肌肉、中腦和垂體中有較高表達水平，在精巢、十二指腸中表達量相對較低。此外，雌、雄性個體相同組織間NPR-B基因的表達水平有差異，這種差異是否與NPR-B基因位于Z染色體有關(guān)有待后續(xù)研究。NPR-B基因在心臟中的高表達預示其可能參與CNP調(diào)節(jié)血管張力的生理功能(Toop & Donald，2004)；其在腦和垂體中的高表達與大鼠中的研究結(jié)果高度一致(Langubetal.，1995)，暗示NPR-B在腦和垂體中具有保守的生理功能。同時，進一步檢測了NPR-B基因在家雞垂體頭部和尾部的表達差異，發(fā)現(xiàn)NPR-B基因特異性高表達于家雞垂體頭部區(qū)域，該區(qū)域垂體細胞主要分泌2種關(guān)鍵垂體激素：ACTH和催乳素。在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，CNP在生理濃度下可以抑制由CRH引起的垂體ACTH釋放(Guild & Cramb，1999)，結(jié)合NPR-B在家雞垂體頭部的特異性分布，本研究暗示家雞CNP/NPR-B系統(tǒng)可能參與調(diào)控家雞垂體激素(ACTH或催乳素)的釋放，進而影響家雞應(yīng)激或繁殖，值得深入探究。