高潔， 劉瑾華， 孫曉紅， 劉詩堯， 沈詠梅， 張修月， 岳碧松*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065； 2.藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610031)

美洲大蠊Periplanetaamericana屬昆蟲綱Insecta蜚蠊科Blattidae大蠊屬Periplaneta。近年來，美洲大蠊及其提取物因在促組織修復(fù)、抗腫瘤、抗氧化和抗菌抗病毒以及保護(hù)心血管、肝臟、脾和胸腺等方面的作用而受到關(guān)注，由美洲大蠊提取物為原料制成的相關(guān)上市藥品如康復(fù)新液、心脈隆和肝龍膠囊等在臨床上廣泛應(yīng)用，且效果顯著(林喆等，2017)。另外，美洲大蠊全基因組測序的完成為探究其藥用分子作用機(jī)理打下基礎(chǔ)(晉家正等，2018)。

長期高脂飲食易引起血脂水平升高，造成高血脂癥、肥胖癥、心腦血管疾病等，與糖尿病和高血壓等密切相關(guān)，對心、肝、腎等器官造成損傷(蘇蓉，于德水，2009；崔立坤，2011；王瑾等，2016)。賴泳等(2012)研究表明，美洲大蠊提取物可降低糖尿病小鼠的血糖水平，并能減輕糖尿病小鼠體質(zhì)量降低、多飲、多食的癥狀。本實(shí)驗(yàn)首次探討了美洲大蠊精粉對長期高脂膳食小鼠血糖和肌酐的影響，并對其降血糖和保護(hù)腎臟的作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討，為美洲大蠊在預(yù)防和治療糖尿病以及保護(hù)腎臟等方面的潛在價(jià)值提供一定的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料

體質(zhì)量18～20 g的SPF級雄性昆明小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(川)2014-189，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，按照屏障系統(tǒng)設(shè)施要求進(jìn)行飼養(yǎng)環(huán)境管理。高脂飼料(基礎(chǔ)飼料中添加10%豬油、2%膽固醇和1%膽酸鈉等)購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 藥品、試劑和儀器

美洲大蠊精粉(批號：170201)由四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；葡萄糖和肌酐測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；動(dòng)物總RNA提取試劑盒購自福際公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×Taq SYBR Green qPCR Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

1.3 分組和給藥

室溫18～22 ℃，光照12 h晝夜交換。40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后禁食12 h，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組(低劑量組：100 mg·kg-1，中劑量組：200 mg·kg-1和高劑量組：400 mg·kg-1)，每組10只，且起始平均體質(zhì)量盡量保持一致。對照組給予0.2 mL生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組給予0.2 mL不同劑量的美洲大蠊精粉混懸液，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃49 d，所有小鼠均以高脂飼料喂養(yǎng)，觀察和記錄小鼠的體質(zhì)量和攝食量。灌胃第42天和第49天禁食12 h后，每組隨機(jī)抽取5只小鼠取血及解剖獲得肝臟和腎臟。

1.4 血清葡萄糖和肌酐檢測

心臟取血，室溫靜置后，3 600 r·min-1離心10 min，取血清，用試劑盒檢測血清葡萄糖(葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法)和肌酐(肌氨酸氧化酶法)含量。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

小鼠的肝臟和腎臟在液氮中速凍后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照說明書分別用組織總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取總RNA和制備cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)引物，F(xiàn)：5’-TTGCTGACCTGAGGAACGC-3’，R：5’-GTCTCCGACCACTGCCACC-3’；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)引物，F(xiàn)：5’-GCCCTCTTGATGGGATGTTC-3’，R：5’-CTGAGTGTGGTTGGAGC-GAT-3’；GAPDH引物，F(xiàn)：5’-TCCGTGTTCCTACCCCCAA-3’，R：5’-GCCCTCAGATGCCTGCTTC-3’(從NCBI中下載基因序列，使用Primer 5設(shè)計(jì)引物)；單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)引物(張敏芳等，2010)，F(xiàn)：5’-GCCCCACTCACCTGCTGCTACT-3’，R：5’-CCTGCTGCTGGTGATCCTCTTGT-3’。引物均由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個(gè)(G-6-Pase和GLUT2)或40個(gè)(MCP-1)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，使用2-△△Ct法計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0進(jìn)行單因素方差分析，多組間兩兩比較使用LSD法，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示各項(xiàng)數(shù)據(jù)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 美洲大蠊精粉對高脂飲食小鼠體質(zhì)量增長率的影響

低、中、高劑量組小鼠的日攝食量分別為6.13 g±0.26 g、5.97 g±0.42 g和5.94 g±0.43 g，與對照組(6.18 g±0.48 g)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

第7、14和21天各組小鼠體質(zhì)量增長差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第28、35、42和49天實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量增長率均低于對照組，其中，第42和49天中、高劑量組小鼠體質(zhì)量增長率顯著或極顯著低于對照組(P<0.05，P<0.01)(圖1)。

2.2 美洲大蠊精粉對高脂飲食小鼠血糖含量的影響

第42天實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖含量均低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第49天與對照組相比，低、高劑量組的血糖明顯下降(P<0.05)(圖2)。

圖1 小鼠體質(zhì)量增長率Fig. 1 Body mass growth rate of mice

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01； 下同

Compared with control group，*P<0.05，**P<0.01； the same below

圖2 小鼠血糖含量的變化Fig. 2 Content change of blood glucose in mice

2.3 美洲大蠊精粉對高脂飲食小鼠血清肌酐含量的影響

第42天和第49天實(shí)驗(yàn)組小鼠血清肌酐含量均低于對照組，其中，第49天低、高劑量組的血清肌酐含量明顯低于對照組(P<0.05)(圖3)。

2.4 美洲大蠊精粉對高脂飲食小鼠肝臟G-6-Pase和GLUT2 mRNA表達(dá)水平的影響

第42天實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟G-6-Pase mRNA表達(dá)水平均低于對照組，其中，中、高劑量組與對照組的差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；GLUT2 mRNA表達(dá)水平與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 小鼠血清肌酐含量的變化Fig. 3 Content change of serum creatinine in mice

第49天低、中、高劑量組小鼠肝臟G-6-Pase mRNA(P<0.05，P<0.05，P<0.01)和GLUT2 mRNA(P<0.01)表達(dá)水平均顯著低于對照組(圖4)。

2.5 美洲大蠊精粉對高脂飲食小鼠腎臟MCP-1 mRNA表達(dá)水平的影響

第42天實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟MCP-1 mRNA表達(dá)水平與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第49天低、中、高劑量組腎臟MCP-1 mRNA表達(dá)水平均顯著或極顯著低于對照組(P<0.05，P<0.05，P<0.01)(圖5)。

圖4 美洲大蠊精粉對小鼠肝臟G-6-Pase和GLUT2 mRNA表達(dá)的影響Fig. 4 Effects of Periplaneta americana powder on the relative expression of G-6-Pase and GLUT2 mRNA in the liver of mice

圖5 美洲大蠊精粉對小鼠腎臟MCP-1 mRNA表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of Periplaneta americana powder on the relative expression of MCP-1 mRNA in the kidney of mice

3 討論

血脂水平升高常常引起肥胖癥。本研究中實(shí)驗(yàn)組小鼠的體質(zhì)量增長率從第3周之后均低于對照組，表明美洲大蠊精粉能有效改善高脂飲食所造成的小鼠肥胖現(xiàn)象。

高血脂癥是糖尿病的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率隨著血糖的升高而增大，糖尿病患者患心血管疾病的危險(xiǎn)性也提高(連建謙，2011)，而長期高脂膳食也能引起血糖升高(田明杰等，2013；Whiteetal.，2016)，所以高血脂癥與高血糖之間的關(guān)系密不可分。糖異生主要發(fā)生在肝臟中，G-6-Pase作為糖異生的限速酶之一，可催化葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖，其活性的降低可抑制糖異生進(jìn)程從而降低血糖濃度(張思聰?shù)龋?017)。GLUT2主要分布在肝臟、腎臟、小腸和胰腺中，可對肝臟葡萄糖進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)。有研究表明，高糖可增加肝細(xì)胞中GLUT2 mRNA表達(dá)水平，以及高濃度胰島素會(huì)降低其濃度(Burcelinetal.，1992；Posticetal.，1993)。Kiho等(1999)發(fā)現(xiàn),冬蟲夏草多糖成分的降血糖活性可能是通過提高糖尿病小鼠肝臟中的葡萄糖激酶活性和減少GLUT2蛋白的含量實(shí)現(xiàn)的。何玉蘭等(2017)認(rèn)為，肝源性糖尿病患者的糖代謝異?？赡芘c其肝臟組織中GLUT2表達(dá)增加有關(guān)。本研究首次探究并初步發(fā)現(xiàn)，灌胃給予美洲大蠊精粉的實(shí)驗(yàn)組小鼠與對照組比，血糖和肝臟中G-6-Pase mRNA表達(dá)水平下降，GLUT2 mRNA表達(dá)水平在第42天無明顯變化但第49天明顯減少，暗示美洲大蠊精粉下調(diào)高脂飲食小鼠的血糖含量可能與其抑制肝臟中G-6-Pase mRNA的表達(dá)和調(diào)節(jié)GLUT2 mRNA表達(dá)水平有關(guān)。

脂代謝紊亂可造成腎臟損傷(Zhangetal.，2016)。梁秀慈等(2013)用高脂乳劑灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)高脂乳劑組小鼠的腎臟病理切片中腎小球和腎小管受到損傷。肌酐是腎功能主要指標(biāo)之一，當(dāng)腎臟損傷時(shí)，肌酐水平明顯上升。MCP-1是參與糖尿病腎炎發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，可促進(jìn)其他炎性因子的釋放和各種炎性細(xì)胞在腎小球聚集，引起腎臟損傷(Lim & Tesch，2012；朱章志，2017)。美洲大蠊及其提取物的腎臟保護(hù)作用及相關(guān)作用機(jī)制尚無研究，本實(shí)驗(yàn)初步探究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的小鼠血清肌酐含量和腎臟中MCP-1 mRNA表達(dá)水平低于對照組，表明美洲大蠊精粉可能通過抑制高脂飲食小鼠腎臟中MCP-1 mRNA表達(dá)水平來減輕腎臟損傷，對腎臟有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，美洲大蠊精粉能改善高脂飲食小鼠的體質(zhì)量、血糖和血清肌酐水平。本研究推測，美洲大蠊精粉降血糖機(jī)制可能與其降低肝臟中G-6-Pase mRNA表達(dá)和調(diào)節(jié)GLUT2 mRNA表達(dá)水平有關(guān)；美洲大蠊精粉可能通過下調(diào)腎臟中MCP-1 mRNA表達(dá)水平從而降低高脂飲食小鼠腎臟炎癥反應(yīng)，減輕腎臟損傷。