羅 瀟，夏彬彬，張 莉,3*，李海龍,3*

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.保定市競(jìng)秀區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，河北保定 071052；3.云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000)

弓形蟲病是由寄生于有核細(xì)胞的剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種危害十分嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，嚴(yán)重危及食品安全與人類健康[1]。人類感染的主要方式之一為誤食含有弓形蟲的肉類及其副產(chǎn)品。云南省大理市位于云南省大理白族自治州，白族特色菜“生皮”是以生豬肉或生豬肝為主料拌蘸水而成，有報(bào)道顯示弓形蟲感染與食入“生皮”密切相關(guān)[2]，云南省動(dòng)物的弓形蟲基因型研究有部分報(bào)道[3]，但大理豬性蟲株的基因型及其生物學(xué)特性的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，且弓形蟲基因型多樣，不同基因型之間毒力差異較大。因此，本研究擬在大理地區(qū)分離弓形蟲蟲株，并進(jìn)一步鑒定其基因型，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新鮮豬肝147份采自大理屠宰場(chǎng)。4月齡雌貓1只購自大理寵物市場(chǎng)，血清弓形蟲抗體檢測(cè)陰性。

1.1.2 蟲株和標(biāo)準(zhǔn)參照DNA RH株基因組DNA由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室惠贈(zèng)；弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)參照DNA為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑 MgCl2(25 mmol/L)、dNTPs(2.5 mmol/L)、10×PCR buffer、rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、6×Loading buffer、DNA Marker DL 500和DNA Marker DL 2 000，購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶MseⅠ、MboⅡ、BsmA Ⅰ、Hinf Ⅰ、RsaⅠ、Sau96 Ⅰ、HaeⅡ、MboⅠ、HhaⅠ、TaqⅠ、NciⅠ、BsiE Ⅰ、HaeⅢ、HpyCH4 Ⅳ、NlaⅢ、AvaⅠ、DdeⅠ、AflⅡ、10×NEB buffer 1-4和BSA，購自北京百靈科生物公司；細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒，購自北京天根公司。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲卵囊的分離 采集屠宰場(chǎng)新鮮豬肝147份，每份取約2 g直接喂貓，每天取糞便鏡檢，直到貓排出卵囊。采用丁健祖等[4]蔗糖漂浮法并稍加改進(jìn)分離弓形蟲卵囊： 取貓糞與450 g/L蔗糖液攪拌混勻、過濾、離心沉淀，吸頂層上清液于載玻片上，覆蓋片后，鏡檢。吸取各管中上清液，1 mL～2 mL生理鹽水稀釋、離心，若糞便含有卵囊，則聚集在沉渣中，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 弓形蟲卵囊DNA的提取 嚴(yán)格按照北京天根動(dòng)物組織DNA提取試劑盒操作說明完成。

1.2.3 弓形蟲DNA的鑒定 用套式PCR擴(kuò)增B1基因部分序列對(duì)所分離蟲株進(jìn)行鑒定。套式PCR引物序列、反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)參考Alfonso Y等[5]的報(bào)道進(jìn)行。引物序列F1：5′-TGTTCTGTCCTATCGCAACG-3′；R1：5′-ACGGATGCAGTTCCTTTCTG-3′；F2：5′-TCTTCCCAGACGTGGATTTC-3′；R2：5′-CTCGACAATACGCTGCTTGA-3′，其中F1和R1為外引物，F(xiàn)2和R2為內(nèi)引物，套式PCR預(yù)期擴(kuò)增片段的大小為530 bp。套式PCR經(jīng)兩輪反應(yīng)，第一輪反應(yīng)體系(25 μL)如下：12.5 μL 2×TaqPCR MasterMix，1.0 μL引物B1外1，1.0 μL引物B1外2，5.0 μL基因組提取液，5.5 μL雙蒸水；第二輪反應(yīng)體系(50 μL)如下：25.0 μL 2×TaqPCR MasterMix，引物B1內(nèi)1、引物B1內(nèi)2各1.0 μL，第1次擴(kuò)增產(chǎn)物4.0 μL，19.0 μL雙蒸水。兩輪PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)均為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 1 min，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后將陽性PCR產(chǎn)物送到生物公司進(jìn)行測(cè)序，以進(jìn)一步確認(rèn)樣品中弓形蟲的B1基因片段。

1.2.4 弓形蟲的基因分型 采用Huang S Y等[6]報(bào)道的多基因位點(diǎn)PCR-RFLP方法對(duì)弓形蟲陽性DNA進(jìn)行基因型鑒定。以弓形蟲陽性DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，再以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板采用套式PCR的方式擴(kuò)增9個(gè)國際標(biāo)準(zhǔn)弓形蟲株的12個(gè)位點(diǎn)(SAG1，5′+3′ SAG2，Alternative SAG2，SAG3，BTUB，GRA6，c22-8，c29-2，L358，PK1，Apico)的DNA，將終產(chǎn)物進(jìn)行酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過比較分析樣本與國際標(biāo)準(zhǔn)蟲株的酶切帶型得到分離株弓形蟲樣本的基因型。套式PCR反應(yīng)體系、引物序列和RFLP酶切體系參照Huang S Y等[6]的報(bào)道。

2 結(jié)果

2.1 大理豬弓形蟲卵囊的分離

通過糞便鏡檢，于第6天在顯微鏡下可見弓形蟲卵囊(命名為TgPDL1)，第7天出現(xiàn)下痢，第7天～第8天鏡下卵囊數(shù)量增多，第9天試驗(yàn)貓死亡。成功分離大理豬弓形蟲卵囊(圖1)。

2.2 弓形蟲的DNA鑒定

卵囊組織DNA能擴(kuò)增出目的片段，大小約530 bp的條帶(圖2)。將該基因測(cè)序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站的BLAST分析，與GenBank登錄號(hào)為AF179871的弓形蟲B1基因完全一致。

2.3 弓形蟲基因分型

將樣本基因酶切圖譜與9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的帶型圖進(jìn)行分析比較，其中5′-SAG2基因位點(diǎn)和3′-SAG2基因位點(diǎn)的酶切圖譜需結(jié)合判定。本研究的基因分型試驗(yàn)中能跑全12個(gè)位點(diǎn)的DNA樣品，將樣品酶切圖譜與弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)株的帶型比較分析后，最終得到卵囊弓形蟲DNA的完整帶型資料(表1)。對(duì)比分析表可得，從卵囊陽性樣品中分出完整位點(diǎn)的樣品，即ToxoDB #9型。

圖1 大理豬弓形蟲卵囊

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.弓形蟲RH株；2.卵囊

M.DNA Marker DL 2 000；1.T.gondiiRH strain；2.oocysts

圖2弓形蟲卵囊的B1基因PCR檢測(cè)

Fig.2 PCR amplification of B1 gene ofT.gondiioocysts

3 討論

弓形蟲蟲株分離方法包括腹腔接種傳代法[7]、直接分離法[8]、體外細(xì)胞培養(yǎng)法[9]等。在弓形蟲的生活史中，弓形蟲包囊被貓吞食后3 d～10 d就能夠排出卵囊，本研究直接給貓喂新鮮肝臟，獲得弓形蟲卵囊，此種方法國內(nèi)鮮見報(bào)道，該方法簡(jiǎn)化了弓形蟲蟲株分離所需的腹腔注射和傳代培養(yǎng)等步驟，具有操作方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)。該方法的不足之處包括多份樣品存在多種不同基因型蟲株，難以區(qū)分，但是對(duì)于單一動(dòng)物因弓形蟲發(fā)病死亡，可采用該法分離病原并鑒定其基因型。

弓形蟲基因分型起源于某個(gè)特定位點(diǎn)基因?yàn)闄z測(cè)弓形蟲基因型的標(biāo)記基因，如Howe D K[10]采用PCR-RFLP技術(shù)SAG2位點(diǎn)，F(xiàn)azaeli A[11]等用GRA6基因，Grigg M E等[12]發(fā)現(xiàn)Bl基因應(yīng)用于弓形蟲株基因型的判定，但是只能檢測(cè)傳統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)的基因型。隨著弓形蟲基因型鑒定的深入研究，同時(shí)利用多位點(diǎn)基因進(jìn)行PCR-RFLP分析逐漸成為主要方法，Su C等[13]、Huang S Y等[6]利用多位點(diǎn)基因進(jìn)行PCR-RFLP分析，都可以區(qū)分出一些少見的或罕見的基因型，明顯提高了對(duì)傳統(tǒng)和非傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)基因型的辨別。

表1 大理豬弓形蟲卵囊(TgPDL1)基因型的鑒定

注：* u-1,u-2和u-3分別代表獨(dú)特的RFLP基因型,WTD.白尾鹿。

Note:*u-1,u-2 and u-3 represent unique RFLP genotypes,respectively,WTD.White-tailed deer.

目前，國內(nèi)關(guān)于弓形蟲蟲株報(bào)道的基因型有ToxoDB#1、ToxoDB#2、ToxoDB#3、ToxoDB#9、ToxoDB#10、ToxoDB#20、ToxoDB#204、 ToxoDB#205、ToxoDB#225[14-15]，本文從云南大理豬中分離到的弓形蟲蟲株為ToxoDB#9。

在我國云南省臨滄、普洱、昭通和文山地區(qū)有關(guān)于豬弓形蟲的基因研究[16]，大理部分人群存在吃生豬肉的習(xí)俗，但是關(guān)于云南大理豬源弓形蟲分離及基因型研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)成功對(duì)大理豬源蟲株的分離和分型，豐富了我國已有的弓形蟲基因型的數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。