杜 琳，王麗芳，姚一萍，馮小慧，宋 潔，張三粉，史 培

(內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010)

牛奶是人類生活中不可或缺的重要食品，同時更是幼兒生長和發(fā)育的天然營養(yǎng)輔食，有“全價食品”之美譽[1]。現(xiàn)如今，牛奶已經(jīng)成為一個民族健康水平提升的關(guān)鍵。人類對牛奶的基本要求應(yīng)該是營養(yǎng)豐富與安全可靠。為提高人類壽命和生活質(zhì)量而生產(chǎn)更多、更好的牛奶及奶制品，是奶牛養(yǎng)殖業(yè)、乳品生產(chǎn)的一項根本任務(wù)。1975年以來，隨著我國奶類消費幅度的增加，我國奶類總產(chǎn)量一直呈穩(wěn)步增長趨勢。2008年至2015年，奶制品加工量和消費量年均遞增率均在6.0%以上[2]。牛奶的質(zhì)量安全也影響著終端奶制品的質(zhì)量安全狀況[3]。

布魯菌病是由布魯菌(Brucella)引起的人獸共患病，在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失[4]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將布魯菌病列為必須報告的動物疫病，我國將布魯菌病列為二類動物疫病[5]。布魯菌病不僅能夠造成巨大的經(jīng)濟損失，而且可引發(fā)人群的高發(fā)病率[6]。人類感染布魯菌主要是因為接觸或食用了被布魯菌感染或污染的動物或動物性食品，其中牛奶是非實驗工作人員感染布魯菌的重要途徑[7]。

由于布魯菌生長緩慢，營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)周期長，布魯菌被認(rèn)為是最常見的實驗源性病原體，我國規(guī)定布魯菌病原的分離鑒定要在三級生物安全實驗室內(nèi)進行[8]。因此，布魯菌PCR檢測技術(shù)應(yīng)用而生，該方法快速、特異、靈敏度高，避免了布魯菌的分離培養(yǎng)，補充了微生物培養(yǎng)法的不足之處，保證了實驗人員的安全，己成為分子生物學(xué)檢測的關(guān)鍵技術(shù)之一。對于PCR方法，DNA模板的質(zhì)量是影響其準(zhǔn)確性和靈敏度的關(guān)鍵因素[9]。由于布魯菌是一種胞內(nèi)寄生菌，牛奶中成分又較為復(fù)雜，因而其核酸提取過程相對較為困難。

目前常用的基因組DNA提取方法主要有堿裂解法、酚-氯仿抽提法、溶菌酶法、試劑盒法、SDS法、CTAB法、加熱煮沸法、Chelex-100法等多種方法。

堿裂解法在細(xì)菌質(zhì)粒DNA提取中應(yīng)用較多。酚-氯仿抽提法是最經(jīng)典的DNA抽提方法，但步驟較為繁瑣。溶菌酶法對革蘭陽性細(xì)菌效果較好。試劑盒法提取的DNA產(chǎn)量和效率相對較高，質(zhì)量也較好，但目前沒有針對乳中細(xì)菌基因組提取的試劑盒。SDS法去除蛋白方面效果較好。CTAB法常用于植物基因組的提取。加熱煮沸法操作簡單、提取時間短，操作成本低，但DNA提取效率降低。Chelex-100法常用于法醫(yī)的PCR鑒定。該方法可用于從微量精斑、血痕、毛發(fā)中提取DNA。

本研究對幾種國內(nèi)外常用的基因組DNA提取方法進行系統(tǒng)的比較，確立了相對較好的從牛奶中布魯菌的DNA提取方法，為布魯菌的分子生物學(xué)快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛奶 超高溫滅菌(UHT)牛奶為伊利240 mL利樂包純牛奶，產(chǎn)地為中國內(nèi)蒙古呼和浩特金山開發(fā)區(qū)金山大道1號。

1.1.2 試劑 布魯菌S2弱毒株由本實驗室保存；Trans2K DNA Marker、基因組DNA小量純化試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；Chelex-100購于sigma公司；EDTA、SDS、蛋白酶K、RNA酶、溶菌酶、Tris-HCl、CTAB、TE緩沖液購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 儀器 超凈工作臺(型號為YJ-875)購自蘇州凈化設(shè)備公司；凝膠成像儀(型號為76s/07832)購自Bio-Rad公司；細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱(型號為ZDP-A2270)購自上海智誠分析儀器制造有限公司，PCR儀(型號為580BR 759)購自Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(型號為PK120951)購自Sigma公司。

1.2 方法

先將布魯菌S2弱毒株菌液加入UHT乳中，終濃度為108cfu/mL,配成模擬牛奶樣本。

1.2.1 堿裂解法[10]取1 mL模擬牛奶樣本，3 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪層，取菌體沉淀，將細(xì)菌沉淀重懸于100 μL預(yù)冷的溶液Ⅰ[50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10 mmol/L EDTA(pH 8.0)]。1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)12.5 mL，0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)10 mL，葡萄糖4.730 g，加ddH2O至500 mL。高壓滅菌15 min ，貯存于4℃。加200 μL新鮮配制的溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH，10 g/L SDS 1 mL；2 mol/L NaOH 1 mL，100 g/L SDS 1 mL，加ddH2O至10 mL)，顛倒數(shù)次混勻(不要劇烈振蕩)，并將離心管放置于冰上2 min～3 min。加入150 μL預(yù)冷的溶液Ⅲ(5 mol/L KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加ddH2O至500 mL，調(diào)至pH 4.8，4℃保存?zhèn)溆?，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3 min～5 min。加入450 μL的酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min。小心移出上清于一新離心管中，加入2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2 min～5 min，4℃以12 000 r/min離心15 min。1 mL預(yù)冷的700 mL/L乙醇洗滌沉淀1～2次，4℃、8 000 r/min離心7 min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。沉淀溶于100 μL TE，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酚-氯仿抽提法[11]取1 mL模擬牛奶樣本，3 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪層，取菌體沉淀,加去離子水至總體積100 μL。加入100 μL已配好的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，充分振蕩后，10 000 r/min離心10 min；轉(zhuǎn)移上清于新的離心管中，按體積的1/10加入3 mol/L NaAc(pH5.2)，按體積的2倍加入1000 mL/L乙醇，輕輕混勻后，置-20℃靜置至少30 min沉淀DNA；4℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清；1 mL的800 mL/L乙醇洗沉淀，10 000 r/min離心2 min；棄去乙醇，風(fēng)干后，加入100 μL的TE緩沖液溶解DNA。

1.2.3 溶菌酶法[12]取1 mL模擬牛奶樣本，3 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪層，取菌體沉淀，用100 μL TE緩沖液重懸菌液，加入10 μL 10 mg/mL溶菌酶，37℃反應(yīng)1 h，然后加入 5 μL 20 mg/mL蛋白酶K混勻，55 ℃反應(yīng) 30 min，再加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，10 000 r/min離心5 min; 取上清液加2倍體積的無水乙醇和1/10體積的NaAc (pH 5.2)，在-20℃下靜置10 min后，于12 000 r/min離心10 min;所得的DNA 沉淀用700 mL/L的乙醇洗2 次,自然風(fēng)干后溶于100 μl的TE，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 試劑盒法 取1 mL模擬牛奶樣本，具體方法按照EasyPure Genomic DNA Kit試劑盒說明書操作。

1.2.5 SDS法[13]取1 mL模擬牛奶樣本，3 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪層，取菌體沉淀。500 μL提取液的離心管中，輕輕混勻，向管中加入50 μL 200 g/L SDS溶液，混勻，不可過于強烈振蕩以防基因組DNA斷裂，65℃保溫10 min，并不時搖動。加入150 μL 5 mol/L KAc，混勻，置冰上20 min～30 min。4℃、15 000 r/min離心15 min,轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入0.7倍體積的異丙醇，混勻，在-20℃沉淀30 min。12 000 r/min離心10 min回收基因組DNA沉淀，吹干后加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。

1.2.6 CTAB法[14]取1 mL模擬牛奶樣本，3 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪層，取菌體沉淀，加預(yù)熱的CTAB(提前加入10 g/L β-巰基乙醇500 μL，65℃水浴45 min，期間每10 min顛倒混勻1次)。冷卻至室溫，加500 μL氯仿∶異戊醇(24∶1)輕輕顛倒混勻，室溫10 000 r/min離心10 min，取上清，約400 μL。重復(fù)上述步驟1～2次至無蛋白析出為止。取上清約300 μL加2倍體積無水乙醇在-20℃靜置至少1 h。10 000 r/min離心10 min，棄上清。加350 μL TE緩沖液，4℃過夜溶解。10 000 r/min離心10 min，取上清，加入1/10體積的3 mol/L的NaAc，2倍體積預(yù)冷的無水酒精，上下輕輕顛倒混勻，使DNA聚成絮狀沉淀，在-20℃靜置至少1 h。10 000 r/min離心10 min，棄上清，注意勿將DNA倒出，加入無水乙醇200 μL，10 000 r/min離心3 min，棄上清。加無水乙醇200 μL，10 000 r/min離心3 min，棄上清。通風(fēng)櫥風(fēng)干大約40 min，加100 μL TE緩沖液，4℃過夜溶解。

1.2.7 加熱煮沸法[15]取1 mL模擬牛奶樣本，3 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪層，取菌體沉淀，加入TE緩沖液，100℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，置-20℃保存。

1.2.8 Chelex-100法[16]取1 mL模擬牛奶樣本，3 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪層，取菌體沉淀。加入200 μL懸浮好的50 g/L Chelex-100溶液，同時加入5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，在55℃水浴中溫浴30 min，振蕩5 s～10 s。然后100℃溫浴8 min后，劇烈振蕩5 s～10 s。12 000 r/min 離心3 min，以沉淀Chelex-100顆粒，取上清液，置-20℃保存。

2 結(jié)果

2.1 多功能酶標(biāo)儀測量8種不同方法提取的基因組DNA的結(jié)果

使用多功能酶標(biāo)儀測量8種不同方法提取的基因組DNA樣品的OD260/OD280值以及DNA濃度。從表1數(shù)據(jù)可知，堿裂解法、酚-氯仿抽提法和加熱煮沸法，OD260/OD280<1.6，表明提取的基因組DNA有酚類或蛋白殘留，DNA純度較差。CTAB法和Chelex-100法，OD260/OD280>1.9，表明提取的基因組DNA有RNA污染。溶菌酶法、試劑盒法和SDS法，OD260/OD280在1.8左右，表明其DNA質(zhì)量較好。

2.2 8種不同方法提取基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

使用8種不同的方法提取基因組DNA，并將其產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖1顯示，堿裂解法、酚-氯仿抽提法、試劑盒法條帶較暗，提取得到的基因組DNA產(chǎn)物較低；堿裂解法、加熱煮沸法和Chelex-100法條帶存在不同程度的降解；溶菌酶法、SDS法和CTAB法條帶較為清晰和明亮。

表1 不同提取方法所得基因組DNA的純度和濃度

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.堿裂解法；2.酚-氯仿抽提法；3.溶菌酶法；4.試劑盒法；5.SDS法；6.CTAB法；7.加熱煮沸法；8.Chelex-100法

M.DNA Marker DL 2 000;1.Alkaline lysis;2.Phenol -chloroform extraction;3.Lysis enzymatic method;4.Kit method;5.SDS method;6.CTAB method;7.Heating boiling method;8.Chelex-100 method

圖1不同方法提取基因組DNA電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of genomic DNA by different
extracted methods

3 討論

牛奶的成分較為復(fù)雜，含有豐富的脂質(zhì)和大量的蛋白，這些物質(zhì)對于基因組DNA的提取都存在干擾作用。其中牛奶中富含酪蛋白，極難消化分解，不溶于水和有機溶劑，是牛奶中菌體DNA提取的主要難點。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)逐漸成為微生物檢測的常用方法，PCR等分子生物學(xué)技術(shù)簡便快捷，可以避免細(xì)菌分離培養(yǎng)的繁瑣和周期長等弊端，而基因組DNA模板的質(zhì)量是影響PCR等分子生物學(xué)技術(shù)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵性因素。尤其是對于一些特殊的微生物檢測具有決定性的影響。布魯菌由于它的易傳染性和培養(yǎng)周期長，培養(yǎng)條件要求高(P3實驗室)以及其本身為一種胞內(nèi)寄生菌和牛奶本身成分的特殊性，提取質(zhì)量好、純度高、濃度高的基因DNA顯得尤為重要。因此，本試驗采用堿裂解法、酚-氯仿抽提法、溶菌酶法、試劑盒法、SDS法、CTAB法、加熱煮沸法和Chelex-100法8種常用的細(xì)菌基因組DNA提取方法進行比較研究。

堿裂解法、酚-氯仿抽提法和加熱煮沸法，OD260/OD280<1.6，表明提取的基因組DNA有酚類或蛋白殘留，DNA純度較差。堿裂解法和酚-氯仿抽提法可能由于使用了有機試劑酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，在試驗后續(xù)中去除不干凈，有酚類殘留；加熱煮沸法可能由于未使用專門去除蛋白的物質(zhì)，導(dǎo)致蛋白殘留。

CTAB法和Chelex-100法，OD260/OD280>1.9，表明提取的基因組DNA有RNA污染。其中CTAB法較多的使用在植物DNA提取上，Chelex-100過去較多應(yīng)用在法醫(yī)檢測痕量物質(zhì)DNA上，有學(xué)者[17]將該方法應(yīng)用在乳中金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌DNA的提取，效果良好；但本次試驗中，提取的DNA存在降解現(xiàn)象，表明該方法可能不適用于革蘭陰性細(xì)菌基因組DNA的提取。溶菌酶法、試劑盒法和SDS法，OD260/OD280在1.8左右，表明其DNA質(zhì)量較好。其中溶菌酶法應(yīng)用了溶菌酶和蛋白酶K等酶，相對較為昂貴。試劑盒法提取的基因組質(zhì)量較好，且降解較小，但含量較低，可能由于牛奶中脂質(zhì)和酪蛋白含量較高，堵塞了部分離心柱，使得DNA與離心柱結(jié)合率較低，從而導(dǎo)致提取的DNA濃度較低。SDS法無需昂貴的蛋白酶和溶菌酶等物質(zhì)，且無需酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)等有毒有害的有機物質(zhì)，試驗步驟也較為簡單。

根據(jù)提取質(zhì)量、濃度、試驗時間、經(jīng)濟等因素綜合考慮，表明SDS法能夠快速高效的提取牛奶中的布魯菌基因組DNA，為牛奶中布魯菌的分子生物學(xué)檢測奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，對于從源頭上保證乳產(chǎn)品的質(zhì)量安全，控制乳產(chǎn)品污染引發(fā)的人獸共患病，消除布魯菌風(fēng)險因子有著重要作用。