劉海霞，溫灝宇，楊波，李曉慧，張鵬飛,3，溫鵬飛,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801；2.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；3.果樹種質(zhì)創(chuàng)制和利用山西省重點實驗室，山西 太原 030031)

原花色素(PAs)，以黃烷-3-醇的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，是一類以低分子量單體或高聚合度的聚合體形式存在的無色酚類化合物[1]，是類黃酮生物合成途徑一個分支的末端產(chǎn)物，對葡萄果實和葡萄酒的顏色、風味、收斂性以及苦味的形成起著重要的作用。前人研究表明，PAs合成涉及類黃酮生物合成途徑的一系列酶促反應[2]，其中二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)是原花色素合成的關(guān)鍵酶之一，以二氫櫟皮黃酮(DHQ)、二氫堪非醇(DHK)和二氫楊梅黃酮(DHM)為底物催化生成原花色素單體黃烷-3-醇，后經(jīng)聚合而形成原花色素。MYB轉(zhuǎn)錄因子參與植物的次生代謝(如黃酮類物質(zhì)的合成[3])、細胞分化、細胞周期、器官形態(tài)建成以及激素和逆境因子應答等過程[4]。目前，已經(jīng)證實MYB轉(zhuǎn)錄因子(如MybPA1)通過控制原花色素生物合成過程中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的時空表達，從而調(diào)控原花色素的生物合成[5，6]。但MybPA1與原花色素合成關(guān)鍵酶DFR的關(guān)系尚未見報道，酵母雙雜交是用來研究蛋白與蛋白之間相互作用的有效方法，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒是酵母雙雜交的基礎(chǔ)[7]。為了進一步明確DFR蛋白的作用和功能，本研究對DFR的氨基酸序列進行了生物信息學分析，并構(gòu)建了DFR基因的酵母雙雜交誘餌載體，同時檢驗其DFR蛋白的自激活活性，以期通過酵母雙雜交技術(shù)來研究與DFR有互作反應的蛋白，從而為原花青素等酚類物質(zhì)的生物合成及調(diào)控機制研究奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

酵母菌AH109、表達載體pGBKT7購于Clontech公司，限制性內(nèi)切酶EcoRI、SacI、T4-DNA連接酶、DNA marker、克隆載體pMD19-T購于TaKaRa公司。提取質(zhì)粒和回收膠試劑盒購于Omega公司，大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、高保真酶定購于全式金生物技術(shù)公司。所有的測序及引物合成都來源于華大有限公司。

1.2 葡萄DFR蛋白生物信息學分析

利用在線軟件InterProScan程序檢索EBI的InterPro數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)預測DFR蛋白序列上潛在的結(jié)構(gòu)域和功能位點。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上保守區(qū)域CDD數(shù)據(jù)庫分析了DFR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/wrpsb.cgi)。在線軟件STRING(http://string-db.org/cgi/input.pl)對DFR蛋白互作進行預測。

1.3 DFR基因片段引物設(shè)計及PCR擴增

1.4 誘餌載體pGBKT7-DFR的構(gòu)建與檢測

將DFR擴增回收產(chǎn)物在16 ℃下與克隆載體pMD19-T進行連接反應45 min，然后在冰浴條件下轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中，挑取陽性菌落進行PCR驗證，成功獲得克隆載體pMD-DFR。提取pMD-DFR質(zhì)粒，用內(nèi)切酶SacI和EcoRI雙酶切pMD-DFR和空載體pGBKT7質(zhì)粒，割膠回收所切出的目的片段，然后在16 ℃下與T4-DNA連接酶連接反應10 h，再迅速轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中，篩選出陽性菌珠后進行菌液PCR驗證，將PCR驗證后的菌液過夜揺菌擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。

1.5 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-DFR的自激活活性檢測

將1.2 μg誘餌質(zhì)粒pGBKT7-DFR中加入10 μL pGADT7空質(zhì)粒和10 μL預變性的鮭魚精DNA(沸水浴5 min，冰浴2 min，重復3 次)在預冷的1.5 mL離心管中混勻，加入200 μL的酵母菌感受態(tài)細胞AH109后迅速進行渦旋震蕩。最后再加入650 μL過夜滅菌后的PEG/LiAc立刻漩渦震蕩25 s，置于搖床中在30 ℃，220 r·min-1下培養(yǎng)1 h。然后加入80 μLDMSO后緩慢上下顛倒混勻，42 ℃下水浴12 min后迅速冰浴4 min，在室溫條件下，10 000 r·min-1，離心45 s后將上清液迅速倒掉，向沉淀中加入300 μL滅菌后的雙蒸水進行渦旋混勻，共轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細胞AH109中，作為試驗組。同時以共轉(zhuǎn)化pGBKT7與pGADT7空質(zhì)粒作為空載體對照，共轉(zhuǎn)化pGBKT7-lam與pGADT7-T作為陰性對照，共轉(zhuǎn)化pGBKT7-53與pGADT7-T作為陽性對照。30 ℃恒溫下，分別將空載體組、陰性對照組、陽性對照組、試驗組的轉(zhuǎn)化液涂在缺陷型SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade板上和含有X-α-Gal的SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d，然后觀察菌落的顏色變化。

1.6 pGBKT7-DFR誘餌載體的毒性檢測

將轉(zhuǎn)化酵母AH109的pGBKT7和pGBKT7-DFR陽性克隆菌液分別涂布于SD/-Trp營養(yǎng)選擇性固體培養(yǎng)基中，30 ℃倒置培養(yǎng)2～4 d，待長出菌落后，分別隨機挑取5 個單菌落于SD/-Trp營養(yǎng)選擇性液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r·min-1恒溫培養(yǎng)24 h，測培養(yǎng)物的OD600值，如果OD600≥0.8，則誘餌載體無毒性，如果OD600<0.8，則誘餌載體對酵母菌有毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DFR蛋白功能域的分析

通過在線InterProScan軟件中檢索的EBI數(shù)據(jù)庫分析，結(jié)果表明，DFR蛋白具有NAD依賴型的差向異構(gòu)酶、脫氫酶N端結(jié)構(gòu)區(qū)域(NAD-dependent epimerase/dehydratase,N-terminal domain)和NAD(P)結(jié)合位點(圖1)。利用NCBI中Blast在線檢索的CDD數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)DFR蛋白具有NADB-Rossmann保守結(jié)構(gòu)域，屬于黃酮還原酶家族成員，擁有NADP、活性和底物的結(jié)合位點和獨特的AR-like-SDR-e元件，具備了還原酶的特征結(jié)構(gòu)序列(圖2)。

圖1 DFR功能位點分析Fig.1 Functional sites of DFR

圖2 DFR蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Analysis of conserved domains of DFR protein

2.2 DFR蛋白互作預測

利用STRING在線軟件對DFR蛋白與MybPA1蛋白互作情況進行預測分析，圖3中的互作網(wǎng)絡顯示DFR蛋白與MybPA1蛋白存在互作關(guān)系，同時DFR與原花色素生物合成相關(guān)酶基因(F3’5’H、ANR、LODX、F3H、LAR)也存在互作關(guān)系。

圖3 DFR蛋白互作網(wǎng)絡預測Fig.3 DFR protein interaction network prediction

2.3 DFR基因PCR擴增

菌液PCR擴增后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測可發(fā)現(xiàn)1 條大小約為1 014 bp片段(圖4)，和預期結(jié)果相同。

圖4 DFR基因片段PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR product of DFR gene fragmentM:2000 DNA marker;1～3:菌液PCR產(chǎn)物M:2000 DNA marker;1-3:PCR product of bacterial solution

2.4 pMD-DFR克隆載體的構(gòu)建及鑒定

將切膠回收后的DFR產(chǎn)物在16 ℃下與克隆載體pMD19-T反應45 min，快速轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，在37 ℃過夜培養(yǎng)待長出大量菌落時，挑取飽滿的單菌落進行菌液PCR陽性篩選與鑒定，可見到與預期相一致的目的片段(圖5)，測序驗證為目的基因，且無堿基突變，成功構(gòu)建了克隆載體pMD-DFR。

圖5 菌液PCR鑒定Fig.5 Identification of bacteria by PCRM:2000 DNA maker;1～4:菌液PCR產(chǎn)物M:2000 DNA Marker;1-4:PCR productof bacterial solution

2.5 pGBKT7-DFR誘餌表達載體的構(gòu)建及鑒定

將空質(zhì)粒pGBKT7和成功構(gòu)建的克隆載體pMD-DFR用EcoRI和SacI內(nèi)切酶進行雙酶切回收目的片段并用T4-DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到單克隆轉(zhuǎn)化子菌株1和2，采用PCR與雙酶切均檢測到質(zhì)粒中插入一段與目的基因大小相當?shù)钠?圖6)，表明誘餌載體pGBKT7-DFR構(gòu)建成功。

圖6 pGBKT7-DFR誘餌載體PCR和雙酶切鑒定Fig.6 Detection of bait vector pGBKT7-DFR with PCR and double enzyme digestion注：A:pGBKT7-DFR誘餌質(zhì)粒PCR驗證；M:2000 DNA ladder；1～2:PCR擴增產(chǎn)物；B:pGBKT7-DFR誘餌質(zhì)粒的雙酶切鑒定；M:2000 DNA ladder；1和2:雙酶切結(jié)果Note:A:Bait vector pGBKT7-DFR PCR identification;M:2000 DNA ladder;1-2: PCR amplification products;B:Detection of bait vector pGBKT7-DFR by doub le enzyme;M:2000 DNA ladder;1-2:results of double enzyme

2.6 pGBKT7-DFR誘餌載體的毒性和自激活檢測

分別挑取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGBKT7和pGBKT7-DFR的酵母菌AH109于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 rpm下振蕩培養(yǎng)24 h，用紫外分光光度計測定在波長為600時培養(yǎng)物的OD值。由表1可見，兩者菌液的OD600值都大于0.8，說明誘餌載體pGBKT7-DFR對AH109沒有毒性作用。分別吸取160 μL空載體對照組、陰性對照組、陽性對照組、試驗組的菌液于含有顯色劑X-α-Gal的SD/-Trp/-Leu與SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade板上，放置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，2 d后發(fā)現(xiàn)只有陽性對照組長出藍色菌落，而其他組在SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal板上長出白色的菌落，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal板上無菌落生長(如圖7)，表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-DFR無法激活AH109酵母菌中指示基因MEL1的表達(MELI編碼α-半乳糖苷酶，隨著顯色劑X-α-Gal的出現(xiàn)陽性菌落就會由白色變成藍色)，因此證實了pGBKT7-DFR誘餌蛋白沒有自激活活性。

3 討論與結(jié)論

二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)擁有特定的NADPH結(jié)合域[8]。DFR基因編碼的蛋白具有NAD(P)結(jié)合位點，在NADPH存在的環(huán)境中，DFR可以特異性的把二氫黃酮醇催化成黃烷-3,4-二醇(即隱色花色素)，是類黃酮代謝中原花色素合成的關(guān)鍵酶之一。自1985年首次從玉米和金魚草中分離以來，DFR基因先后從矮牽牛、擬南芥[9]、油菜、水稻、馬鈴薯、非洲菊、玫瑰、玉米[10，11]等草本植物，以及甜櫻桃[12]、石榴、山葡萄、獼猴桃[13]、山竹子、荔枝[14]等果樹中得到了克隆。

表1 誘餌質(zhì)粒的OD600值Table 1 The OD600 value of bait plasmid

圖7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母AH109細胞自激活活性檢測結(jié)果Fig.7 Results of self-activation activity of yeast AH109 cells transformed by recombinant plasmid

DFR基因廣泛分布于各植物的不同組織中，有研究發(fā)現(xiàn)該基因表達于枸杞不同的組織中，如根、莖、葉等。除了影響著原花色素的生物合成，還在單寧、花色苷等酚類物質(zhì)的合成途徑中起著重要作用[15]。潘麗晶等[16]發(fā)現(xiàn)：石斛蘭的花中明顯缺少藍色和黃色，這種現(xiàn)象與DFR的活性有著不可分割的關(guān)聯(lián)。有研究證實，在赤霞珠葡萄果實中，DFR的活性和基因表達水平直接影響著葡萄果實原花色素的生物合成[17]，在原花色素合成途徑中起著至關(guān)重要的作用[18，19]。本課題組前期研究結(jié)果表明：DFR和MybPA1在葡萄的不同時期都有表達，MybPA1及其MybPA1蛋白的表達與DFR基因呈負相關(guān)[20]。王曉平等人[21]的研究表明，京亞葡萄中的MybPA1、MybPA2與原花色素的形成有關(guān)，Bogs等人[6]研究MybPA1對西拉葡萄中的原花色素的生物合成調(diào)節(jié)有特效。由于MYB 轉(zhuǎn)錄因子往往是通過調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達而影響原花色素合成[22]，所以推測MybPA1可能是通過調(diào)節(jié)DFR的表達從而調(diào)控原花色素的合成。同時從在線軟件STRING網(wǎng)絡預測圖中得出，MybPA1蛋白與DFR蛋白存在互作關(guān)系，但是互作機制還未明確需要更深一步的研究。

酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白與蛋白互作的一種有效方式，此技術(shù)不僅用于研究已知蛋白間的相互作用，在篩選與誘餌蛋白互作的未知蛋白方面也起著關(guān)鍵作用[23]。構(gòu)建誘餌表達載體是利用酵母雙雜交系統(tǒng)大量篩選互作蛋白的基礎(chǔ)。本研究通過生物信息學分析得出，DFR蛋白屬于黃酮還原酶家族成員，擁有NADB-Rossmann保守結(jié)構(gòu)域和NADP結(jié)合位點，具有還原酶的典型特征；從預測蛋白互作網(wǎng)絡圖中得出，DFR蛋白與MybPA1蛋白存在互作關(guān)系。成功構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-DFR，細胞生長分析顯示DFR對酵母菌AH109無細胞毒性，通過檢測AH109中報告基因MEL1的活性，證明誘餌載體pGBKT7-DFR對酵母菌AH109無自激活，該誘餌載體可用于篩選酵母雙雜交系統(tǒng)中與DFR互作的蛋白，從而為深入研究DFR的功能奠定了重要基礎(chǔ)。