辛燕花，張鐵丹，張建華，王菲，連廣平

(1.忻州師范學(xué)院生物系，山西 忻州 034000；2.廣州萬物生健康產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 廣州 )

香菇(Lentinulaedodes)是一種著名的藥食同源的食用菌，它不僅是我國的一種特產(chǎn)還是世界第二大食用菌。它被稱為民間的“山珍之王”且有“菇中皇后”之美譽(yù)。然而，一個(gè)不容忽視的問題是香菇是食用菌中含甲醛的典型代表，香菇中的甲醛主要是香菇在生長發(fā)育過程中逐步形成的，是香菇特有的正常生理代謝產(chǎn)物[1]。近年來，大量的研究者對香菇中內(nèi)源性甲醛的形成機(jī)制進(jìn)行了研究，并且取得了一定的研究進(jìn)展[2～5]。然而，針對香菇中甲醛的降解機(jī)制的研究報(bào)道較少。為了防止甲醛造成生物體的致死以及突變，生物體建立了多種修復(fù)機(jī)制，使之能在含甲醛的環(huán)境中更好地生存，其中谷胱甘肽(GSH)依賴型的甲醛氧化途徑就是微生物中廣泛存在的一條解毒途徑[6]。作用于這條途徑的關(guān)鍵酶為甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)ADH)，是脫氫酶家族中的一員，存在于大多數(shù)原核及所有的真核生物中，對生物體內(nèi)甲醛解毒具有重要作用[7]。目前針對香菇甲醛脫氫酶的研究比較有限，有研究者對香菇中的甲醛脫氫酶進(jìn)行了克隆(GenBank GAW01839.1)，同源序列比較發(fā)現(xiàn)與熒光小菇中甲醛脫氫酶有91%的相似性，針對香菇甲醛脫氫酶對香菇中甲醛的含量的影響研究還未見任何報(bào)道。

本研究以香農(nóng)8號作為試驗(yàn)菌株，通過研究不同的栽培條件下香菇不同生長階段甲醛脫氫酶酶活和甲醛含量的變化，并進(jìn)一步通過在香菇液體培養(yǎng)基中添加甲醛脫氫酶來探討該酶對香菇甲醛含量的影響，為研究甲醛降解酶的生物學(xué)功能提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇菌種：香農(nóng)8號菌種，購于福建食用菌研究所。

主要試劑：甲醛標(biāo)準(zhǔn)品，上海生工試劑公司；其他試劑均為分析純。

培養(yǎng)基：香菇袋栽培養(yǎng)基：培養(yǎng)料一：木屑50%、麥麩10%、豆餅粉2%、糖0.5%、含水量65%；培養(yǎng)料二：甘蔗渣50%、米糠12.5%、石膏1.5%、尿素0.3%、磷酸二氫鉀0.3%；培養(yǎng)料三：玉米芯50%、木屑20%、麥麩18%、石膏1.5%、含水量65%。PDB液體培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，用紗布過濾，冷卻后加入葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，加蒸餾水定容至1 L。121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2 儀器設(shè)備

B-CJ-2FCS型超凈臺(tái)：佳寶凈化工程設(shè)備有限公司(蘇州)；SHA-CA型恒溫?fù)u床：遠(yuǎn)華機(jī)械設(shè)備有限公司(河北)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：鄄城創(chuàng)新儀器有限公司(山東)；TG16 WS型低速離心機(jī)：湘智離心機(jī)儀器有限公司(長沙)；WYC-52T型電熱鼓風(fēng)干燥箱：喆圖科學(xué)儀器有限公司(上海)；YXQ-LS-100 A型立式壓力蒸汽滅菌器：禾普生物科技有限公司(西安)；UV-5100型紫外可見分光光度計(jì)：元析儀器有限公司(上海)；KQ5200DV數(shù)控超聲波清洗器：江東精密儀器有限公司(蘇州)。

1.3 香菇不同生長階段甲醛含量與甲醛脫氫酶的關(guān)系

1.3.1 香菇栽培

將上述3種香菇袋栽培養(yǎng)基按配方稱料拌勻。分別裝入 17 cm× 40 cm×0.05 cm 規(guī)格聚丙烯袋中，121 ℃滅菌60 min，冷卻后接種香菇菌種，每個(gè)處理各重復(fù)3次，菌絲發(fā)滿菌棒后以塑料大棚式栽培，按常規(guī)出菇管理模式管理。

取樣方法：菌絲取樣(菌絲發(fā)滿半袋、發(fā)滿全袋、轉(zhuǎn)色期采樣)，每次隨機(jī)采樣進(jìn)行3次重復(fù)。菌柄和菌蓋取樣：各潮次子實(shí)體取樣品進(jìn)行甲醛檢測。

1.3.2 甲醛脫氫酶酶活的測定

香菇甲醛脫氫酶的酶活測定參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.3.3 甲醛的測定

對香菇不同生長階段的甲醛含量進(jìn)行測定，甲醛的測定參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。以甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.015 4x-0.000 7，R2=0.999 4。

1.4 不同來源的甲醛脫氫酶對香菇菌絲體甲醛含量的影響

1.4.1 甲醛脫氫酶的誘導(dǎo)

在PDA液體培養(yǎng)基中接種等量的香菇菌種后，分別加入甲醛，使甲醛的終濃度依次為：0、0.006‰、0.012‰、0.060‰、0.12‰，以不添加甲醛為對照，在恒溫?fù)u床中28 ℃，100 r·min-1培養(yǎng)8天，收集菌絲體，并測定甲醛脫氫酶的酶活，選取最佳的甲醛誘導(dǎo)體系。

1.4.2 甲醛脫氫酶的分離純化

對經(jīng)過甲醛誘導(dǎo)的香菇菌絲體以及配方一栽培下的新鮮香菇子實(shí)體中的甲醛脫氫酶進(jìn)行初分離純化，參照文獻(xiàn)進(jìn)行[8]。

粗酶液制備:取適量的香菇液體培養(yǎng)基，過濾得到菌絲球，于研缽加入菌絲球、石英砂、0.02 mol·L-1pH為8.0 的Tris-HCl 緩沖液(比例為1∶1∶2)，冰浴研磨 5 min后，置于高速離心機(jī)中4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，即為 FADH 的粗酶液。稱取新鮮的香菇子實(shí)體0.1 g，按照上述方法制備粗酶液。

硫酸銨沉淀: 取上述粗酶液，加入硫酸銨至終濃度為 30%，攪拌 30 min后置于高速離心機(jī)中4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，并加入硫酸銨至終濃度為 80%，攪拌 30 min后置于高速離心機(jī)中4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min。沉淀溶于0.02 mol·L-1、pH 8.0的Tris-HCl 緩沖液，即得復(fù)溶液。

透析: 將上述復(fù)溶液裝入透析袋中(體積占2/3)，用0.02 mol·L-1、 pH 8.0的Tris-HCl透析 2 h，回收透析袋中的復(fù)溶液，即為 FADH 的初酶液，并將其保存于4 ℃冰箱待用(經(jīng)甲醛誘導(dǎo)后所得的FADH初酶液記為FADH1，經(jīng)香菇子實(shí)體所得的初酶液記為FADH2)。

1.4.3 菌絲體的培養(yǎng)

在香菇液體培養(yǎng)基中接種等量的香菇菌種后，加入經(jīng)甲醛誘導(dǎo)后香菇發(fā)酵所產(chǎn)的甲醛脫氫酶FADH1和香菇自身子實(shí)體分離得到的FADH2，在恒溫?fù)u床中28 ℃，100 r·min-1培養(yǎng)8 d，收集菌絲體，測定香菇菌絲體中的甲醛含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇不同生長階段甲醛的含量變化

對不同栽培料培養(yǎng)下的香菇各個(gè)生長階段及不同部位的甲醛含量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，不同的培養(yǎng)料栽培的香菇在不同的生長階段及不同的部位甲醛的含量有明顯的差異。其中，培養(yǎng)料一和培養(yǎng)料二栽培下的香菇在菌絲體生長階段甲醛的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于子實(shí)體生長階段，并且在形成子實(shí)體后，香菇菌蓋中甲醛的含量要明顯低于菌柄中的甲醛含量，說明在這兩種培養(yǎng)料下香菇中甲醛含量的隨著香菇的生長發(fā)育成熟，甲醛的含量逐漸的降低。而培養(yǎng)料三栽培的香菇在菌絲體生長的階段甲醛的含量明顯低于子實(shí)體生長階段，比較形成子實(shí)體后香菇菌柄和菌蓋中甲醛的含量發(fā)現(xiàn)，菌蓋中甲醛的含量明顯高于菌柄中甲醛的含量，說明在培養(yǎng)料三栽培下的香菇隨著香菇的生長發(fā)育成熟，甲醛的含量逐漸升高。

圖1 不同培養(yǎng)料栽培下的香菇甲醛含量Fig.1 The effect of different cultivation medium on the content of formaldehyde in Letinous Edodes

2.2 香菇不同生長階段甲醛脫氫酶的酶活變化

對不同培養(yǎng)料栽培的香菇各個(gè)生長階段的甲醛脫氫酶酶活進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2。從圖2可以看出，不同培養(yǎng)料栽培的香菇在不同的生長階段甲醛脫氫酶的酶活不同。其中，培養(yǎng)料一和二栽培的香菇在菌絲體生長階段檢測到甲醛脫氫酶的酶活明顯低于子實(shí)體生長階段，并且發(fā)現(xiàn)香菇在子實(shí)體生長階段菌柄中的甲醛脫氫酶的酶活明顯低于菌蓋，說明隨著香菇的生長發(fā)育，香菇中甲醛脫氫酶的酶活一直在上升，這一結(jié)果正好與上述香菇(培養(yǎng)料一、二)中甲醛含量隨著香菇的生長發(fā)育不斷降低相吻合。培養(yǎng)料三栽培的香菇在菌絲體生長階段檢測到甲醛脫氫酶的酶活明顯高于子實(shí)體生長階段，并且發(fā)現(xiàn)香菇在子實(shí)體生長階段菌柄中的甲醛脫氫酶的酶活明顯高于菌蓋，說明隨著香菇的生長發(fā)育，香菇中甲醛脫氫酶的酶活一直在降低，這一結(jié)果同樣與上述香菇(培養(yǎng)料三)中甲醛含量隨著香菇的生長發(fā)育不斷升高相吻合。綜合上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)香菇中甲醛的含量與甲醛脫氫酶的酶活有一定的關(guān)系。

圖2 不同培養(yǎng)料栽培下香菇FADH的酶活Fig.2 The effect of different cultivation medium on the formaldehyde dehydrogenase activity of Letinous Edodes

2.3 不同來源的甲醛脫氫酶對香菇菌絲體中甲醛含量的影響

2.3.1 添加經(jīng)甲醛誘導(dǎo)后的甲醛脫氫酶對香菇菌絲體中甲醛含量的影響

通過測定在香菇液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的甲醛誘導(dǎo)香菇產(chǎn)甲醛脫氫酶的酶活發(fā)現(xiàn)，不同濃度的甲醛含量對香菇菌絲體產(chǎn)甲醛脫氫酶有一定的影響(圖3)。從圖3中可以看出，與對照相比，在香菇菌絲體中添加一定量的甲醛可以誘導(dǎo)香菇菌絲體產(chǎn)甲醛脫氫酶，并且在添加外源甲醛的濃度為0.006‰時(shí)，香菇菌絲體中產(chǎn)甲醛脫氫酶的酶活達(dá)到最大值0.68 U·g-1。

圖3 不同濃度的甲醛對香菇甲醛脫氫酶的影響Fig.3 The effect of different concentration of formaldehyde on the formaldehyde dehydrogenase activity of Letinous Edodes

對添加甲醛濃度為0.006‰的香菇液體培養(yǎng)基中的甲醛脫氫酶進(jìn)行分離純化后得到甲醛脫氫酶的初酶液。在香菇液體培養(yǎng)基中添加不同體積的初酶液(0.5、1.0、1.5、2.0 mL)，以不添加初酶液的香菇液體培養(yǎng)基為對照，進(jìn)行培養(yǎng)后，測定香菇菌絲體中甲醛的含量，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，香菇菌絲體中甲醛的含量隨著添加甲醛脫氫酶的濃度增加明顯下降，說明甲醛脫氫酶可以有效的降低香菇中甲醛的含量。

圖4 不同濃度的甲醛脫氫酶1對香菇中甲醛含量的影響Fig.4 The effect of different concentration of formaldehyde dehydrogenase 1 on formaldehyde of Letinous Edodes.

2.3.2 添加香菇子實(shí)體中甲醛脫氫酶對香菇菌絲體中甲醛含量的影響

將提取新鮮香菇子實(shí)體中的甲醛脫氫酶的初酶液按照不同的濃度添加到香菇的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后，測定香菇菌絲體中甲醛的含量，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，與對照相比，香菇菌絲體中甲醛的含量隨著添加甲醛脫氫酶的濃度增加明顯下降，甲醛脫氫酶顯著的降低了香菇菌絲體中甲醛的含量。

圖5 不同濃度的甲醛脫氫酶2對香菇中甲醛含量的影響Fig.5 The effect of different concentration of formaldehyde dehydrogenase 2 on formaldehyde of Letinous Edodes.

3 討論

香菇中甲醛的形成規(guī)律受環(huán)境因素的影響較明顯，在本研究中，采用了三種不同的培養(yǎng)料栽培香菇，其中培養(yǎng)料一和培養(yǎng)料二栽培下的香菇中甲醛的含量隨著香菇的生長發(fā)育成熟逐漸下降；培養(yǎng)料三栽培下的香菇中甲醛的含量隨著香菇的生長發(fā)育成熟逐漸遞增，多數(shù)研究結(jié)果表明香菇在菌絲培養(yǎng)階段甲醛的含量較低(1.46～29.9 mg·kg-1)，隨著原基形成至子實(shí)體成熟，菇體中甲醛含量呈遞增(6.51～20.45 mg·kg-1)[2～4,10]，而本研究中所采用的培養(yǎng)料一栽培下的香菇在子實(shí)體階段甲醛含量明顯低于菌絲體階段，更合適用來栽培香菇。

甲醛脫氫酶作為甲醛氧化途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，對生物體中的甲醛解毒起著關(guān)鍵的作用。在本研究中，不同培養(yǎng)料栽培的香菇在不同的生長階段甲醛含量不同，甲醛脫氫酶的酶活性也呈現(xiàn)出一定的變化。比較在同一培養(yǎng)料栽培下，甲醛脫氫酶的酶活越高高，甲醛含量越低；在不同培養(yǎng)料栽培下的香菇，同樣表現(xiàn)出甲醛脫氫酶的酶活越高，甲醛含量越低的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步驗(yàn)證甲醛脫氫酶對香菇中甲醛的氧化作用，通過在香菇液體培養(yǎng)基中添加甲醛脫氫酶來檢測香菇中甲醛的含量。

本研究中的香農(nóng)8號在PDB液體的基礎(chǔ)上，添加了以甲醛作為碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，對產(chǎn)生的甲醛脫氫酶的酶活進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，添加一定濃度甲醛的培養(yǎng)基中香菇菌絲體產(chǎn)FADH的酶活要顯著高于對照，說明香菇在外源甲醛的誘導(dǎo)下，體內(nèi)甲醛氧化途徑中的甲醛脫氫酶能夠進(jìn)行高效表達(dá)，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，代謝香菇體內(nèi)的甲醛。因此，通過優(yōu)化香菇發(fā)酵條件，提高香菇產(chǎn)甲醛脫氫酶的酶活，來降低香菇體內(nèi)的甲醛是行之有效的方法。其次，對添加了經(jīng)甲醛誘導(dǎo)后產(chǎn)生的FADH及香菇子實(shí)體自身的FADH后，發(fā)現(xiàn)這兩種來源的酶都能可以有效的降低香菇體內(nèi)的甲醛。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步對這兩種來源的酶進(jìn)行分離純化，得到純品，探討二者結(jié)構(gòu)的相似與差異，研究其酶學(xué)性質(zhì)，為探討香菇中甲醛含量提供一定的理論依據(jù)。