杜賓，暢引東，董海龍，何瑞，李新鳳，徐玉梅，王建明*

(1.山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801；2.太原學院 園藝系，山西 太原 030012)

番茄是全世界栽培最為普遍的果菜之一,也是我國各個蔬菜產區(qū)主要種植的蔬菜種類。近年來，隨著我國生鮮番茄及其制品消費的高速增長和番茄種植面積的不斷增加，連作重茬問題變的日益突出，番茄土傳病害亦日趨嚴重，其中番茄枯萎病(Tomato Fusarium wilt)已成為影響番茄生產可持續(xù)發(fā)展的一個重要的限制因素。由于其病原菌在番茄整個生長期均可侵染，而且其初侵染來源也比較廣，加之其防治比較困難，所以給番茄的生產造成了嚴重的影響[1,2]。目前，選育和種植抗病品種是解決該病害最有效的方法之一，明確番茄的抗病機理則是培育抗病品種的基本前提。在寄主與病原的互作過程中，植物抗病相關基因的產物直接參加了抵抗病原物侵染的活動，它們的表達調控遵循了一定的規(guī)律。通過對植物抗病相關基因表達規(guī)律進行研究，有利于了解相關基因的功能，為有效的防治此類病害提供理論基礎，進而利用成熟的基因工程技術。

病原可誘導寄主細胞內一系列編碼蛋白質的基因表達，這些蛋白中有許多在植物防衛(wèi)和應激反應中起重要作用，被稱為病程相關蛋白(Pathogenesis-related protein, PR)[3]。研究還發(fā)現各種誘抗劑的使用，可使番茄植株細胞組織、多種酶類和PR蛋白的活性及含量等產生明顯變化，從而增強番茄植株的抗病性[4]。例如，香蕉植株經1.5 mmol·L-1外源甲基茉莉酮酸酯處理后，激活香蕉植株的抗病防御體系，其體內的幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶和總酚類物質的含量升高，其體內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多氧化物酶(PPO)、氧化氫酶(CAT)及苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)等酶的活性升高[5]。葡聚糖酶作為植物超敏反應中合成的一類重要水解酶，其編碼基因Glu過量表達才足以降解侵入的病原真菌，最終使得植株免于受害[4]。研究還表明，水楊酸、乙烯/茉莉酸和脫落酸信號傳導途徑參與了植物對病原菌的抗性反應[5]。Wang等人以擬南芥為模式寄主進行研究，發(fā)現轉錄因子ATAF1可以調節(jié)對病原鐮孢菌的抗性反應[6]。通過比較枯萎病脅迫下番茄抗感品種的生理響應，發(fā)現在病原菌脅迫下抗感病品種中各種酶都會有響應，且抗病品種中酶活性明顯高于感病品種[7]。當甜瓜感染尖孢鐮孢菌甜瓜?；?號生理小種后，抗性品種根部的氧化物酶(POX)、多氧化物酶活性(PPO)及酚類化合物(PCs)含量顯著升高，說明這些酶在品種抗性誘導中起到重要的作用[8]。酶活性的增強，涉及到相關基因的上調表達，受其編碼基因調控。

多年來，研究人員采用分子標記技術、表達序列標簽、抑制差減雜交技術、基因芯片、基因組學等多種生物學方法對寄主與病原互作條件下植物中差異表達基因及其功能進行了大量的研究[9]，篩選出大量編碼病程相關蛋白基因，有些病程相關蛋白編碼基因在植物受侵染脅迫條件下的作用機制還有待進一步的研究。本研究擬采用實時熒光定量PCR手段對病原菌侵染番茄過程中番茄PRP5(Pathogenesis-related protein 5)、PRP10(Pathogenesis-related protein 10)、ERTF1B(Ethylene-responsive transcription factor 1B-like)、DRRP206(Disease resistance response protein 206-like)和PO(Polyphenol oxidase)等基因的實時表達情況進行分析研究，以進一步明確番茄病程相關基因在侵染脅迫條件下的表達調控機理。

1 材料與方法

本試驗于2016年5月-2017年8月在山西農業(yè)大學農學院植物病理學重點學科實驗室和作物遺傳育種重點學科實驗室進行。

1.1 供試寄主

番茄栽培品種中蔬四號(購自太谷農資市場)：將番茄種子浸入含2%有效氯的次氯酸鈉消毒液，放入搖床中室溫下振蕩消毒30 min，轉速設為150 r·min-1，用滅菌水沖洗3次。轉移至新的滅菌水中55 ℃條件下溫湯浸種15 min，轉移至28 ℃滅菌水中浸種7 h。然后將種子均勻播種于裝有滅菌沙土的育苗盤，放置于光照培養(yǎng)箱中，溫度設定為28 ℃。待育苗盤中番茄出苗超過80%后，將光照培養(yǎng)箱光照和黑暗時間段調節(jié)為14 h∶10 h；光照條件下溫度設定為25 ℃，黑暗條件下溫度設定為20 ℃；濕度光照條件下設為80%，黑暗條件下設為60%；注意控制培養(yǎng)基質濕度，適時澆水，以防徒長。

1.2 供試菌種

供試菌種為尖孢鐮孢菌番茄?；途?，由山西農業(yè)大學農學院植物病理學實驗室提供。菌株培養(yǎng)和孢子收集：將活化的菌株接種于綠豆湯培養(yǎng)液，在恒溫搖床中培養(yǎng)4 d，溫度和轉速設置為25 ℃和150 r·min-1。4 d后離心收集孢子，使用血球計數板測定孢子濃度，用滅菌水將孢子濃度調節(jié)到1×106mL-1，保存于4 ℃條件下備用。

1.3 接種及取樣方法

待番茄幼苗長至3葉期時，將幼苗從育苗盤挖出，浸入無菌水中漂洗根部，隨后將其置于1×106mL-1的孢子懸浮液中，浸根1 h，以無菌水處理做空白對照，每個處理共30株幼苗，設3次重復。接種后的幼苗，轉移到裝有無菌水的三角瓶中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，設置生長條件為28 ℃，濕度80 %，光暗比為14∶10(定期搖瓶，以增加液體中含氧量)。

參照前人對尖孢鐮孢菌對寄主植物早期侵染過程的研究，本試驗設計在接種后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和7 d 取樣，選取植株根莖部位，樣品可立即進行RNA提取或立即用液氮冷凍，保存在-80 ℃超低溫冰箱備用。本試驗共設置3個生物學重復。

1.4 DNA和RNA的提取與反轉錄合成單鏈cDNA

番茄幼苗根部DNA和總RNA，分別依照DNAsio Plus(9770, Takara)和RNAsio Plus(9108，Takara)的步驟進行提取，提取的DNA和總RNA分別經瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測后，使用Eppendorf紫外分光光度計測定其濃度。將其一部分稀釋到工作濃度后，儲存于4 ℃冰箱中備用，其余樣本儲存于-80 ℃冰箱。

RNA反轉錄，選用反轉錄酶PrimeScriptTMRT reagent Kit(RR047, Takara)，依照其步驟將樣本RNA反轉錄為單鏈cDNA，反轉錄前使用反轉錄試劑盒提供的試劑去除RNA中殘余的基因組DNA。反轉錄后的單鏈cDNA經Eppendorf紫外分光光度計測定濃度，并稀釋為工作濃度，儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.5 基因表達的實時熒光定量PCR分析

本試驗中選取的番茄病程相關蛋白編碼基因編號詳見表1。從NCBI網站獲得基因序列，在番茄的表達序列標簽數據庫進行比對，依據比對結果選取相似性較高區(qū)域基因序列在IDT網站(Integrated DNA Technologies)設計實時熒光定量PCR引物，設計的引物經過Premier Primer 6.0軟件進行序列結果分析，并在NCBI網站使用Primer-blast程序以尖孢鐮孢菌和番茄基因組數據為對照進行引物特異性的檢測。設計的引物由上海生工生物有限公司合成，得到引物后分別以尖孢鐮孢菌和番茄的基因組DNA為模板進行PCR擴增，以驗證引物的特異性。選取特異性好的引物進行下一步試驗，本試驗中所選用的引物信息詳見表2。

為理清病原菌入侵后寄主植物抗病的分子機制，以不同處理條件下罹病植株的單鏈cDNA為模板，以番茄ACTIN基因作為內參，選用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(RR820，Takara)分別對供試的基因進行實時熒光定量PCR，以測定病原與寄主互作條件下目的基因的表達情況。PCR反應采用兩步法，其條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s，62 ℃退火15 s，共40個循環(huán)，每次循環(huán)的最后一步收集SYBR Green熒光，在循環(huán)結束時從65 ℃開始繪制溶解曲線直到95 ℃，每次增加0.5 ℃，每次反應時間5 s。每個反應體系設置3個技術重復，共設3次生物學重復。

1.6 數據統計分析

試驗數據分析根據目的基因和各個內參基因的閾值循環(huán)(Ct)，用2-ΔΔCT計算相對表達量；在Excel 2010和SPSS22.0軟件上分別運用T-測驗法、單因素方差分析和事后Tukey多重比較檢驗處理間的差異顯著性。

目的基因相對表達量的增減比率按照以下公式進行計算：

(處理組目的基因相對表達量-對照組目的基因相對表達量)/ 對照組目的基因相對表達量=目的基因相對表達量增減比率

2 結果與分析

2.1 病原菌脅迫下番茄幼苗生長

水培條件下，對照組和處理組中番茄幼苗在接種后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和7 d時的生長情況如圖1所示。從圖1可看出，接種尖孢鐮孢菌番茄?；途甑奶幚斫M番茄幼苗植株在接種后48 h內未表現出萎蔫癥狀，在接種7 d時即可表現出明顯的萎蔫癥狀；而對照組中未接種的番茄幼苗在3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和7 d 均未表現出萎蔫癥狀。

2.2 病原菌脅迫下番茄病程相關基因相對表達量分析

番茄植株的病程相關基因在接種尖孢鐮孢菌番茄?；途旰蟛煌瑫r期的動態(tài)表達結果見表2。從表2可知，PRP10基因在接種病原菌的番茄幼苗植株中表達受到抑制，其相對表達量在接種后6 h下降至0.51，在12 h～7 d這段時間基因相對表達量基本維持在0.72～0.81之間，而對照組中該基因表達量在6 h時升至2.13，在12 h 時升至5.62，隨后緩慢下降至1.84，處理組和對照組之間基因相對表達量差異極顯著。PRP5基因在接種病原菌的番茄幼苗植株中表達呈上調狀態(tài)，在侵染48 h時該基因表達量為0.73，而對照組的相對表達量高達1.42，在接種7 d時該基因的相對表達量顯著上升，達到1.74，遠高于對照組。ERTF1B基因在接種病原菌的番茄幼苗植株和對照組中的相對表達量很低，除24 h、48 h和7 d之外，其相對表達量值基本一致，無顯著差異。DRRP206和PO兩基因在接種病原菌的番茄幼苗植株中的表達在3～12 h時呈上調狀態(tài)，在這段時間內兩基因的相對表達量持續(xù)上升，在12 h時的相對表達量分別為3.08和2.53,而對照組中兩基因的相對表達量值則整體低于處理組。此后兩基因在侵染后7 d的相對表達量分別下降至1.01和0.74，但其相對表達量值整體高于對照組。

表1 實時熒光定量PCR引物信息Table 1 Information of the primers used for real-time quantitative PCR

表2 番茄病程相關基因的相對表達量值Table 2 Relative expression values of pathogenesis-related genes of SL

注：CK為對照組未接種番茄植株，CH65為處理組接種的番茄植株；采用T-測驗方法比較對照組與處理組中同一基因的相對表達量差異，結果由*表示P<0.05，**表示P<0.01；采用單因素方差分析和事后Tukey’s多重比較對同一組內相同基因不同處理階段的相對表達量進行顯著性分析，不同大寫字母表示P<0.01，相同字母表示P>0.05。

Note: CK denotes the non-inoculated plant, CH65 denotes the inoculated plant, the treatment group；The relative expression value differences between each pair of samples (the expression of the same gene in CK and treatment) were tested using the t-test and indicated by *P<0.05 and**P<0.01; Within the same group, the relative expression value differences of the same gene at different periods were tested using the One-Way ANOVA and post hoc Tukey’s multiple comparisons, the different capital letters denoteP<0.01, the same letter denotesP>0.05.

圖1 番茄幼苗接種病原菌后不同時期生長情況Fig.1 Growth condition of tomato seedling at different periods after inoculation of F. oxysporum f. sp. lycopersici 注：3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h 和 7 days 表示番茄幼苗采集時期; CK為2株空白對照，Treatment為接種尖孢鐮孢菌番茄?；偷奶幚斫M。Note: 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, and 7 days denote tomato seedlings collection periods; CK denotes two seedlings inoculated with sterilized water, treatment denotes two seedlings inoculated with F. oxysporum f. sp. lycopersici.

2.3 病原菌脅迫下番茄病程相關基因相對表達變化趨勢分析

番茄病程相關基因在接種尖孢鐮孢菌番茄?；途旰蟛煌瑫r期處理組和對照組中的相對表達量增減比率見圖2。從圖2中可知，在接種后6 h時僅有PRP5和DRRP206基因在處理組和對照組中的相對表達量增減比率有明顯的增長，其中PRP5基因在此后的相對表達量增減比率呈下降趨勢，于12 h時降至-0.27，隨后其相對表達量增減比率于接種后7 d達到最高值為3.82；而DRRP206基因的相對表達量增減比率繼續(xù)增長，于12 h時達到最高值達3.15；在此時，PO基因的相對表達量增加比率達到其最高值達3.39，此后DRRP206和PO兩基因的相對表達量增減比率持續(xù)下降，于24 h達最低值，之后又呈緩慢上升趨勢，在接種7 d時的相對表達量增減比分別為2.46和1.82；PRP10和ERTF1B基因在接種病原菌后其相對表達量增減率處于負值水平，相對表達量呈下降趨勢，ERTF1B基因在接種后24 h時相對表達量增減比率達最低值，隨后上升呈正值水平，并于48 h形成一個峰值，而PRP10基因在接種后其相對表達量增減比率一直為負值，呈緩慢下降趨勢，在接種后12 h后相對表達量比值逐漸回升。結合表2，可看出本試驗中涉及的病程相關基因在處理組和對照組中的增減比率與其相對表達量值基本呈正相關。

圖2 番茄受侵染時病程相關基因的相對表達量增減比率Fig.2 Increase and decrease rate of relative expression for tomato pathogenesis-related genes

3 討論

本試驗中番茄幼苗植株在接種尖孢鐮孢菌番茄?；途?8 h內未表現出任何癥狀，在接種7 d后即可觀察到顯著的萎蔫癥狀。尖孢鐮孢侵入寄主植物2 d后，病原菌即可侵入維管束，同時出現大量的侵填物堵塞導管[11,12]。在侵入7 d后，菌絲可抵達木質部導管[13]，被侵入的皮層區(qū)(cortical area)細胞質和細胞壁大多數被分解[14]，菌絲體的大量產生使導管堵塞妨礙了水分運輸，從而引起植株萎蔫[15]。本試驗中番茄幼苗在接種48 h雖未能在表型上觀察到明顯的病狀，但是在處理組和對照組番茄病程相關基因表達研究中發(fā)現在接種病原菌48 h內，部分病程相關基因的相對表達量值有較大差異，推測其在病原與寄主的互作中參與了抵抗病原菌侵染的活動。

本試驗選取的番茄病程相關基因中，NM_001288651編碼番茄病程相關蛋白10，多數的病程相關蛋白可通過SA、JA、ABA或ET等信號復合物誘導，從而擁有抵抗微生物活性，研究發(fā)現經尖孢鐮孢菌誘導可引起病程相關蛋白10編碼基因的轉錄表達[16]。該編碼基因的同源STH-2-like基因與番茄對大麗輪枝菌的抗性密切相關[17]。Deepti等人的研究發(fā)現該類基因的表達可以清除由代謝和脂質過氧化產生的醛類細胞毒性[18]。本試驗中，該基因在病菌入侵初期該基因相對表達量值顯著低于對照組，無法正常表達，可能是由于病菌與植株間處于信號識別階段，病原菌中某些物質抑制其表達。在菌株識別成功開始侵入后，植株中該基因表達仍然較低，可能該基因的表達與侵染病原種類有較大的相關性，土豆中該類基因表達表現出較強的小種特異性[19]，亦可能與番茄品種抗病性相關。XM_004238172編碼番茄病程相關蛋白5，在多種植物中該基因家族可由病原菌誘導表達，在歐李抗病品種中該類蛋白能夠在真菌入侵時激活其抗性反應并增強歐李抗病性[20]，而本試驗中該基因在侵染初期對于病原菌的入侵響應不強，在入侵7 d后才有響應，表明供試番茄品種中該基因在病原菌侵染初期未能及時參與到寄主對病原菌的抗性反應。XM_004234188編碼番茄乙烯應答轉錄因子1B，轉錄因子在植株的內生免疫體系中扮演著重要角色，而乙烯應答轉錄因子是激素路徑的集成器(integrator)，負責許多JA/ET響應抗性基因的轉錄調控[21]，在本試驗中該基因在處理組和對照組中的表達量都很低，表明供試番茄品種中該基因未參與到番茄的抗病反應。XM_004245506編碼番茄抗病響應基因206，番茄植株受侵染時該基因會有持續(xù)、大量的表達[22]，本試驗中XM_004245506基因在應對菌株入侵時的表達量顯著增多，隨后降低，表明該基因與寄主植物的抗性相關，參與了寄主對病原的抗性反應。AW154864.1編碼多酚氧化酶，該酶是植物的防御相關蛋白，在植株遭受逆境、創(chuàng)傷和侵染時形成，表現出多家族性，在番茄中有7個編碼多酚氧化酶的基因[23]。諸多的研究表明植物中多酚氧化酶水平與其對病原菌的抗性呈正相關[24]，在本研究中病原菌誘導后番茄中該基因的表達顯著高于對照組，且番茄病株根部會出現褐化，表明番茄植株中該基因參與了對病原侵入的響應，也有研究表明該基因的表達是植物中一種正常的代謝反應[25]，因此該類基因是否參與寄主對病原的抗性反應還有待進一步的研究。

4 結論

綜上所述，番茄品種中蔬四號在接種尖孢鐮孢菌番茄?；途旰蟮谄咛旒幢憩F出明顯的萎蔫癥狀，屬感病品種。本試驗選取的番茄病程相關基因在病原菌脅迫條件下的表達量各異，其中PRP10、PRP5和ERTF1B基因在尖孢鐮孢菌脅迫侵染條件下表達量較低，可能是其在參與抗性反應過程中受到了病原菌致病因子的抑制；而DRRP206和PO基因在尖孢鐮孢菌脅迫侵染條件下表達量較高，但整個植株在接菌7 d后表現出的仍然是感病的狀態(tài)，沒有顯示出很強的抗性，表明這些基因在病原菌侵染過程中被誘導表達，但不足以使植物抗病。