陳蓉，李陽，白靜，曹靜，彭成，國(guó)錦琳

冬蟲夏草為麥角菌科冬蟲夏草菌Ophiocordycepssinensis寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上形成的幼蟲尸體及子座的干燥復(fù)合體，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，具有補(bǔ)腎益肺，止血化痰的功效[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)的三大補(bǔ)藥之一，市場(chǎng)需求巨大，近年來冬蟲夏草安全性特別是砷含量超標(biāo)受到越來越多的關(guān)注。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局于2016年報(bào)道市場(chǎng)抽檢冬蟲夏草產(chǎn)品砷含量為4.4～9.9 mg/kg[2]，均超出現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)砷的限值1～2mg/kg[3]。

重金屬對(duì)人體毒性，目前比較明確。如血鉛濃度的升高會(huì)損害兒童的認(rèn)知能力和智商等[4,5]；鎘具有腎臟毒性、損傷骨骼和生殖系統(tǒng)等問題[5,6]；砷可以引起組織損傷和機(jī)體障礙，主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、造血系統(tǒng)[6]等；銅是人體必需的微量元素，但急性銅中毒會(huì)引起黏膜刺激、胃腸炎、肝腎損害等[7]；鉻是人體必需的微量元素，但過多的攝入鉻會(huì)對(duì)人體造成危害，Cr6+為致癌物，攝入過多會(huì)損害機(jī)體健康[8]。冬蟲夏草中主要報(bào)道有上述重金屬。

國(guó)家或相關(guān)部門對(duì)食品、藥品的重金屬規(guī)定了相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)。冬蟲夏草作為名貴藥材，有必要建立報(bào)道較多的重金屬的限量標(biāo)準(zhǔn)。本文采用微波消解ICP-MS建立冬蟲夏草中的鉛、砷、鎘、鉻、銅的含量測(cè)定方法，為后續(xù)冬蟲夏草重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)制定奠定基礎(chǔ)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

電子天平（XS205DU，瑞士梅特勒）、電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜（NexION 350X，美國(guó)珀金埃爾默）、大通量微波消解儀（UltraWAVE，意大利Milestone）、超純水儀（Milli-Q Intagral 3，美國(guó)密理博）。

1.2 試劑

硝酸為優(yōu)級(jí)純（太倉(cāng)滬試試劑有限公司，上海）、去離子水、內(nèi)標(biāo)溶液（6Li.Sc.Ge.Y.In.Tb.Bi)（100μg/mL、美國(guó)珀金埃爾默）、Al.As.B.Ba.Be.Bi.Cd.Co.Cr.Cu.Fe.Ga.Li.Mg.Mn.Ni.Pb.Sb.Sb.Sn.Sr.Ti.Tl.V.Zn混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心）。

1.3 藥材來源

本實(shí)驗(yàn)用冬蟲夏草藥材來自于四川、西藏、青海，經(jīng)成都中醫(yī)院大學(xué)國(guó)錦琳教授鑒定為冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis，留樣保存在中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。樣品信息如表1-1：

表1-1 冬蟲夏草樣品信息表

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置：分別取Al.As.B.Ba.Be.Bi.Cd.Co.Cr.Cu.Fe.Ga.Li.Mg.Mn.Ni.Pb.Sb.Sb.Sn.Sr.Ti.Tl.V.Zn混合標(biāo)準(zhǔn)溶液元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL）5.00ml于50 mL容量瓶中，以2%硝酸溶液定容至刻度，即得10.00mg/L的Al.As.B.Ba.Be.Bi.Cd.Co.Cr.Cu.Fe.Ga.Li.Mg.Mn.Ni.Pb.Sb.Sb.Sn.Sr.Ti.Tl.V.Zn混合標(biāo)準(zhǔn)溶液混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)系列的配制：取10.00mg/LAl.As.B.Ba.Be.Bi.Cd.Co.Cr.Cu.Fe.Ga.Li.Mg. Mn.Ni.Pb.Sb.Sb.Sn.Sr.Ti.Tl.V.Zn混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5ml于50mL容量瓶中，以2%硝酸溶液定容至刻度，即得1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，分取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、1mL、2.50mL分別置于50mL容量瓶中，以2%硝酸溶液稀釋至刻度，即得濃度為2.00μg/L、5.00μg/L、10.00μg/L、20.00μg/L、50.00μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 樣品的制備[9]

準(zhǔn)確稱取約0.2000g冬蟲夏草樣品于聚四氟乙烯消解罐中，加入6mL濃硝酸，蓋上密封蓋，放入微波消解儀中消解，消解程序如表1-2。消解完全后，加酸至2mL，取出冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)移25mL容量瓶，即為供試品溶液，另取一消解罐，不加樣品，直接加入6mL硝酸，以相同消解程序消解，得到空白溶液。

表1-2 微波消解程序表

2.3 樣品含量測(cè)定[9]

按下表1-3設(shè)定ICP-MS的條件，分析中采用6Li.Sc.Ge.Y.In.Tb.Bi為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)校正方法校正儀器，采用ICP-MS分析方法中外標(biāo)校正分析方法測(cè)定。待儀器穩(wěn)定后，按順序依次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、試劑空白溶液和試樣溶液進(jìn)行測(cè)定，以計(jì)數(shù)比率為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

表1-3 ICP-MS儀器條件表

模擬階段電壓 -1750V脈沖電壓 1050V偏轉(zhuǎn)板電壓 -10.5V數(shù)據(jù)采樣模式 跳峰采集采樣深度 10mm重復(fù)次數(shù) 3次掃描次數(shù) 100次

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 按照樣品ICP-MS儀器條件，對(duì)50μg/L砷、鉛、鎘、鉻、銅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算RSD值（n=6）。當(dāng)RSD＜5%時(shí)，認(rèn)為儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照2.2項(xiàng)下方法制備冬蟲夏草供試品溶液，分別于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h后進(jìn)樣，按照2.3項(xiàng)下ICP-MS儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算RSD值（n=5），當(dāng)RSD＜5%時(shí)，認(rèn)為冬蟲夏草供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.3 準(zhǔn)確度考察 取冬蟲夏草藥材樣品粉末3份，每份0.2000g，取一份加入0.5mL1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，即加入量為20μg/L。按照1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照1.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率。

3 結(jié)果

3.1 各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1-4 各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

按照2.3項(xiàng)下ICP-MS儀器條件，對(duì)50μg/L砷、鉛、鎘、鉻、銅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算RSD值，見表1-5。

表1-5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表可知，砷、鉛、鉻、銅、鎘濃度的RSD值分別為0.88%，0.13%，0.40%，0.20%，0.27%，均小于5%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按照2.2項(xiàng)下方法制備冬蟲夏草供試品溶液，分別于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h后進(jìn)樣，按照2.3項(xiàng)下ICP-MS儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算RSD值結(jié)果見表1-7。

表1-7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，砷、鉛、鉻、銅、鎘濃度的RSD值分別為0.88%，0.13%，0.40%，0.20%，0.27%，均小于5%，表明冬蟲夏草供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 準(zhǔn)確度考察

取冬蟲夏草藥材樣品粉末3份，每份0.2g，按照表1-8，加入標(biāo)準(zhǔn)，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見表1-8。

表1-8 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

由表可知，砷、鉛、鉻、銅、鎘的加樣回收率分別為78%、92%、106%、88%、86%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。As的回收率偏低的原因可能有，As的性質(zhì)不穩(wěn)定，在上述微波條件下易轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)。

3.5 冬蟲夏草砷、鉛、鎘、鉻、銅含量分布

表1-10 含量統(tǒng)計(jì)表

由表可知，As的含量范圍為1.96～20.96mg/kg，Pb的含量范圍為0.19～1.26mg/kg，Cr的含量范圍為0.17～3.88mg/kg，Cu的含量范圍為9.67～15.40mg/kg，Cd的含量范圍為0.01～0.20mg/kg。

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)部分中藥材鉛、砷、鎘、銅的限量分別為5mg/kg，2mg/kg，0.3mg/kg，20mg/kg。因此，除砷外，鉛、鎘、銅的含量均不超標(biāo)。

3.6 冬蟲夏草砷含量問題

其中砷含量為1.58～20.96mg/kg，總體均值的統(tǒng)計(jì)范圍為2.19～10.35mg/kg，與CFDA的報(bào)道相符。

4 結(jié)論與討論

4.1 前處理方法的選擇

重金屬檢測(cè)的前處理方法有干法灰化[10]，濕法消解[11]和微波消解[12,13,14]等。微波消解的優(yōu)勢(shì)相對(duì)于干法消解和濕法消解優(yōu)勢(shì)更明顯，預(yù)處理時(shí)間更短，與樣品更有效地接觸，試劑用量少，操作簡(jiǎn)單安全、大大減少易揮發(fā)元素的損失和實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)樣品的污染，降低了空白值，提高了方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。綜合各種重金屬的檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)選擇電感耦合等離子體發(fā)射光譜質(zhì)譜（ICP-MS）法為本實(shí)驗(yàn)冬蟲夏草的檢測(cè)方法，該方法適用食品、中藥材、土壤中的Pb、As、Hg、Cd、Cu、Cr等元素的測(cè)定元素，該方法檢測(cè)靈敏度高，線性范圍廣，檢測(cè)速度快，冬蟲夏草元素濃度在該方法線性范圍內(nèi)。

4.2 加酸量對(duì)消解效果的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加酸量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加酸不足結(jié)果偏低，因此建議同類實(shí)驗(yàn)預(yù)試判斷加酸量。

4.3 砷高水平的原因分析

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的5種元素除砷外，其它元素均在中國(guó)藥典規(guī)定的限量范圍內(nèi)，相對(duì)安全。砷含量為1.58～20.96mg/kg，超過中國(guó)藥典限量，總體均值的統(tǒng)計(jì)范圍為3.57～9.66mg/kg，考慮到冬蟲夏草每日服用量低，每日攝入砷元素的量相對(duì)有限，因此冬蟲夏草食用相對(duì)安全。

現(xiàn)有研究表明，冬蟲夏草砷可能主要來自土壤，左華麗等報(bào)道冬蟲夏草中的砷含量與其產(chǎn)區(qū)土壤的砷含量呈正相關(guān)關(guān)系，因此建議冬蟲夏草服用前，應(yīng)清洗干凈附著的泥沙[15]。

后續(xù)研究考慮考察冬蟲夏草預(yù)處理對(duì)砷元素含量的影響，同時(shí)評(píng)價(jià)冬蟲夏草中砷元素的組成進(jìn)一步考察其安全性，為科學(xué)制定冬蟲夏草砷元素限量奠定基礎(chǔ)。