盧君蓉，李文兵，王世宇，傅超美

良附丸為中藥傳統(tǒng)成方制劑丸劑的代表品種之一，是高良姜、醋香附兩味中藥等份、粉碎、混合而制成的水泛丸，功善溫胃理氣，在中醫(yī)臨床上用于寒凝氣滯胃脘疼痛之證，癥見寒凝氣滯、脘腹吐酸、胸腹賬滿等[1]。據(jù)文獻調(diào)研，良附丸被先后研制成多種不同劑型的新制劑，如良附口服液[2]、良附口服微乳[3]、良附顆粒[4]、良附胃漂浮片[5]、良附滴丸[6]、良附軟膠囊[7]等，且其抗炎、鎮(zhèn)痛和抑制應(yīng)激性胃潰瘍等效果相當(dāng)于或優(yōu)于原水泛丸制劑[8-11]。然而，良附丸及其新研發(fā)制劑質(zhì)量控制多以α-香附酮的含量為指標(biāo)，僅反映了制劑中醋香附藥材的成分，高良姜藥材所含成分的體現(xiàn)較少。HPLC指紋圖譜不僅能夠全面地表征單味中藥材的細(xì)微差別，還能夠更加全面的表征制劑及其生產(chǎn)各關(guān)鍵環(huán)節(jié)中各藥材成分，更加符合中藥多成分、多層次、多靶點的復(fù)雜特性[12-14]，對經(jīng)典傳統(tǒng)制劑的縱向深入研究及橫向二次開發(fā)均具有非常重要的意義。在前期研究香附醋制前后化學(xué)成分變化及建立同時檢定良附丸中高良姜素、圓柚酮、ɑ-香附酮等5種特殊性成分的基礎(chǔ)上[15,16]，探索建立良附丸HPLC指紋圖譜控制模式，以更加全面地反映制劑特征，進一步完善良附丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，為加快其二次開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀（G1312B四元梯度泵、G1322A脫氣機、G1316B柱溫箱、G1329B自動進樣器、G1315C二極管陣列紫外檢測器），賽多利斯Bp211DAG電子天平（德國Sartorius），超聲波清洗器KQ5200DB（昆山市超聲儀器有限公司）。

高良姜素（中國藥品生物制品檢定所，批號111699-200501），α-香附酮（江西本草天工科技有限責(zé)任公司，批號1443-080529），香附烯酮（自制，純度＞98%），良附丸（北京同仁堂制藥有限公司，批號分別：2083024、2083025、3088042、3082248、3083042、4082082、4082083、4082085、15081216、15081311）。乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250×4.6 mm，5μm）；流動相：A：0.2%磷酸溶液，B：乙腈，梯度洗脫程序見表1；檢測波長：242 nm；記錄時間：45 min；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液制備

取高良姜素、香附烯酮、α-香附酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含高良姜素、香附烯酮、α-香附酮分別為0.25、0.05、0.02 mg混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取良附丸粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 儀器精密度試驗 取同一批良附丸粉末（批號：2083024），精密稱定，按2.3項下制備供試液，連續(xù)進樣6次，考察儀器的精密度。結(jié)果表明，各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積比值無明顯變化，RSD分別0.01%～0.03%和0.02%～0.12%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批良附丸粉末（批號：2083024），精密稱定，按2.3項下制備供試液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積比值無明顯變化, RSD分別0.02%～0.05%和0.03%～0.20%，表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批良附丸粉末（批號：2083024），精密稱定，按2.3項下制備供試液，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積比值無明顯變化，RSD分別0.01%～0.08%和0.04%～0.16%，表明重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰確定 取10批良附丸粉末，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別進樣10μL，記錄色譜圖。在供試品色譜中，共確定10個共有峰，其中2號峰（S峰）為高良姜藥材中主要指標(biāo)性成分高良姜素；6、7號色譜峰分別為香附藥材中主要成分香附烯酮和α-香附酮。結(jié)果見圖1。

圖1 良附丸HPLC指紋圖譜

2.5.2 指紋圖譜共有峰相對保留時間和相對峰面積 以2號峰（高良姜素）作為內(nèi)參比峰，計算各色譜峰與內(nèi)參比峰的保留時間及峰面積比值，得各色譜峰的相對保留時間及相對峰面積值。結(jié)果表明，10批良附丸樣品相對保留時間RSD在0.01～0.02%，相對峰面積在RSD在2.83～19.92%。

表2 10批良附丸指紋圖譜相對保留時間

表3 10批良附丸指紋圖譜相對峰面積

2.5.3 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版本）》對10批良附丸指紋圖譜進行相似度分析。結(jié)果各批次良附丸指紋圖譜相似度在0.956～1.000之間，說明相似度良好。結(jié)果見表4和圖2。

表4 10批良附丸指紋圖譜相似度計算結(jié)果

圖2 10批良附丸指紋圖譜疊加圖

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本試驗采用二級陣列檢測器（DAD檢測器），對良附丸樣品溶液進行了全波長掃描（190～400 nm），并具體考察了235 nm、242 nm、254 nm、266 nm、280 nm、320 nm、360 nm、400 nm等8個波長，綜合考慮良附丸指紋圖譜色譜峰數(shù)量和質(zhì)量,最終以242 nm處基線平穩(wěn)，溶劑干擾少,檢測的圖譜信息量最多且峰形較好,故選擇242 nm作為指紋圖譜的測定波長。

3.2 流動相的選擇

流動相分別考察了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液系統(tǒng)等多個系統(tǒng)，并進行梯度洗脫比較,結(jié)果表明,在乙腈-0.2%磷酸溶液在表1的流動相條件下所得色譜峰峰形較好，且分離度高，故選擇乙腈-0.2%磷酸溶液的梯度洗脫條件。

3.3 色譜峰的標(biāo)定與指認(rèn)

本試驗建立了良附丸制劑HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了8個共有色譜峰，并通過對照品比對等指認(rèn)了其中3個共有峰，分別為高良姜素（2號）、香附烯酮（6號）和α-香附酮（7號）。該HPLC指紋圖譜具有方法簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點，能夠更加全面地反映良附丸制劑特征，為完善良附丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。