陳順軍，宋樂樂，李彥鵬，王瑞華，程兵*

1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，河南洛陽(yáng) 471003；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院影像科，河南洛陽(yáng) 471003；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河南省分子影像醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450052；

多項(xiàng)腫瘤細(xì)胞凋亡顯像研究表明，化療后腫瘤細(xì)胞凋亡程度明顯增加；在一定時(shí)間內(nèi)行凋亡檢測(cè)，能夠探測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，達(dá)到監(jiān)測(cè)化療療效的目的[1-6]。Cohen等[7]合成一種新的小分子化合物5-氟代烷基-2-甲基-丙二酸（5-fluoropentyl-2- methyl-malonic acid，ML-10)，能選擇性地聚集于凋亡細(xì)胞，具有較好的臨床應(yīng)用前景[7-10]。國(guó)內(nèi)關(guān)于18F-ML-10用于化療后腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)的報(bào)道較少。本研究利用紫杉醇誘導(dǎo)VX2腫瘤動(dòng)物模型體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。對(duì)細(xì)胞凋亡模型動(dòng)物行18F-ML-10 PET/CT全身斷層顯像，測(cè)量腫瘤部位的最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（maximum standardized uptake value，SUVmax）。對(duì)比相應(yīng)的流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率，探討18F-ML-10 PET/CT全身斷層顯像用于判斷荷瘤兔體內(nèi)細(xì)胞凋亡的可能性，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與動(dòng)物 PET/CT成像系統(tǒng)（Siemens Biography True Point64 52環(huán)），Syngo工作站（Siemens True D融合軟件），放射性活度測(cè)量?jī)x器（Capintec CRC-25R/W型放射性活度測(cè)量?jī)x器），18F-ML-10放射性核素示蹤劑（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科PET中心提供），壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-SG46-280S，上海博訊公司）。藥物：麻醉藥物（戊巴比妥鈉：Merck公司，德國(guó)）、紫杉醇注射液（深圳萬(wàn)樂藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 ml/60 mg，批號(hào)：H20056878）、生理鹽水、碘伏。一次性使用留置針（24G AD醫(yī)療集團(tuán)公司），無(wú)菌注射器，輸液器，棉簽，彎盤。流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司），Annexin V FITC凋亡試劑盒（Invitrogen公司）。VX2荷瘤兔模型12只，雄性，體重2.0～3.0 kg，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（豫）2015-0004]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 VX2細(xì)胞荷瘤兔12只，按完全隨機(jī)化法分為化療組和對(duì)照組，每組6只，化療組經(jīng)耳緣靜脈輸注紫杉醇注射液（按兔子體表面積175 mg/m2計(jì)算）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11]，對(duì)照組靜脈滴注等量生理鹽水。2 d后，將12只兔逐個(gè)麻醉后，按兔體重計(jì)算 4.44×106Bq/kg（120 μCi/kg，0.2 ml）經(jīng)耳緣靜脈注射18F-ML-10，60 min后分別進(jìn)行PET/CT顯像。CT參數(shù)：常規(guī)全身掃描，80 kV，自動(dòng)毫安；PET參數(shù)：1.5 min/床位，采集3個(gè)床位，掃描的圖像采用迭代重建法重建，分別得到橫斷面、矢狀面和冠狀面CT、PET、PET/CT斷層融合圖像。應(yīng)用ROI技術(shù)勾畫瘤體，測(cè)定腫瘤組織的SUVmax。顯像結(jié)束后，立即處死 VX2細(xì)胞模型動(dòng)物，取出腫瘤組織，分為兩部分，一部分用于流式細(xì)胞儀檢測(cè) VX2細(xì)胞凋亡情況，另一部分用作蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosin staining，HE）觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件，用Mann-Whitney檢驗(yàn)比較化療組與對(duì)照組的差異；采用Spearman秩相關(guān)分析化療組瘤體組織SUVmax與腫瘤細(xì)胞凋亡百分率之間的相關(guān)性，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組VX2兔腫瘤模型SUVmax與細(xì)胞凋亡百分率比較 注射核素顯像劑 60 min后行18F-ML-10 PET/CT全身斷層顯像，化療組瘤體部位的SUVmax為 1.65±0.33，對(duì)照組瘤體部位SUVmax為 0.59±0.17，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）。利用 Annexin VFITC/PI定量法檢測(cè)VX2細(xì)胞凋亡情況，化療組細(xì)胞凋亡百分率為（26.22±5.41）%，對(duì)照組為（4.55±2.23）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）。

2.2 化療組瘤體組織 SUVmax與腫瘤細(xì)胞凋亡百分率的相關(guān)性 化療組瘤體組織SUVmax與腫瘤細(xì)胞凋亡百分率呈正相關(guān)（rs=0.943，P=0.005）。18F-ML-10 PET/CT全身斷層顯像顯示：化療組瘤體部位攝取18F-ML-10較明顯，表現(xiàn)為放射性分布稍濃聚區(qū)（圖1A）；對(duì)照組瘤體部位攝取18F-ML-10不明顯（圖1B）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)VX2細(xì)胞凋亡情況 化療組細(xì)胞凋亡百分率較多；對(duì)照組細(xì)胞凋亡百分比非常少（圖2）。化療組HE染色病理切片鏡下見較多的凋亡細(xì)胞呈片狀分布，對(duì)照組HE染色病理切片鏡下所見以正常VX2細(xì)胞為主（圖3）。

圖1 VX2荷瘤兔動(dòng)物模型18F-ML-10 PET/CT全身斷層融合顯像。A. VX2荷瘤兔紫杉醇化療后，18F-ML-10 PET/CT全身斷層融合顯像，MIP圖顯示兔左側(cè)腋窩水平放射性分布略濃聚，CT顯示為左側(cè)腋窩皮下腫瘤部位，PET/CT融合圖像顯示瘤體部位可見放射性分布略濃聚，SUVmax為1.76（箭）；B.對(duì)照組荷瘤兔18F-ML-10 PET/CT全身斷層融合顯像，CT顯示腫瘤位于左側(cè)腋窩皮下，MIP圖、PET/CT融合圖均顯示腫瘤部位未見明顯放射性分布濃聚，SUVmax為0.58（箭）

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組荷瘤兔VX2細(xì)胞凋亡百分率。A.經(jīng)紫杉醇化療后VX2細(xì)胞凋亡百分率：右上象限：Annexin V（+）／PI（+），晚期凋亡細(xì)胞（0.7%）；右下象限：Annexin V（+）／PI（-），早期凋亡細(xì)胞（30.7%），細(xì)胞凋亡百分比較高；左下象限：Annexin V（-）/PI（-），正常細(xì)胞（68.5%）。B.對(duì)照組VX2細(xì)胞凋亡百分率：右上象限：Annexin V（+）／PI（+），晚期凋亡細(xì)胞（2.3%）；右下象限：Annexin V（+）／PI（-），早期凋亡細(xì)胞（4.0%）；細(xì)胞凋亡百分比較低，左下象限：Annexin V（-）/PI（-），正常細(xì)胞（81.7%）

圖3 荷瘤兔VX2腫瘤病理結(jié)果。紫杉醇化療后VX2腫瘤病理切片顯示較多的凋亡細(xì)胞呈片狀及條狀分布，細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮、深染，細(xì)胞核濃縮（箭，A）；對(duì)照組VX2腫瘤病理圖片顯示極少量的凋亡細(xì)胞，呈單個(gè)分布，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核濃縮，深染，內(nèi)可見凋亡小體（箭，HE，×200，B）

3 討論

細(xì)胞凋亡在腫瘤的治療過(guò)程中具有重要作用，并直接影響腫瘤患者的預(yù)后。分子影像為實(shí)體檢測(cè)細(xì)胞凋亡提供了有效工具[12]。ML-10是一種用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)的新型化合物，其原理是：磷脂酰絲氨酸（Ps）是構(gòu)成細(xì)胞膜的成分之一，細(xì)胞正常狀態(tài)下依靠移位酶和翻轉(zhuǎn)酶維持Ps位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，凋亡發(fā)生早期，這兩種酶活性喪失，而另外一種爬行酶的激活使Ps由膜內(nèi)側(cè)移向外側(cè)，并且暴露在細(xì)胞膜外側(cè)，在細(xì)胞膜上，細(xì)胞膜的酸化使18F-ML-10酸化，酸化后的18FML-10結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞膜上的爬行酶激活和細(xì)胞膜不可逆的去極化，促進(jìn)已經(jīng)酸化的18F-ML-10通過(guò)細(xì)胞膜疏水性的結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，酸化18F-ML-10與胞質(zhì)內(nèi)帶負(fù)電荷的蛋白結(jié)合，促使更多的18F-ML-10進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)ph系統(tǒng)功能紊亂，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)pH值降低到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以下，細(xì)胞發(fā)生脫水、皺縮等凋亡細(xì)胞所特有的改變，以上變化相互協(xié)同完成，導(dǎo)致18F-ML-10集聚在凋亡細(xì)胞內(nèi)，這種特性僅發(fā)生在凋亡細(xì)胞[7-10]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，化療組腫瘤部位攝取18F-ML-10，呈放射性分布濃聚區(qū)域，而對(duì)照組腫瘤部位未見明顯攝取18F-ML-10?；熃M與對(duì)照組 SUVmax比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果證實(shí)化療組腫瘤細(xì)胞凋亡百分比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）?；熃M細(xì)胞凋亡百分比與瘤體組織SUVmax呈正相關(guān)（rs=0.943），表明18F-ML-10 PET/CT顯像可用于細(xì)胞凋亡評(píng)估。

既往已有研究將18F-ML-10用于人體腫瘤放療后的療效評(píng)估，Allen等[13]利用18F-ML-10評(píng)價(jià)全腦放療對(duì)腦腫瘤患者的療效，結(jié)果顯示腫瘤體積的變化和18F-ML-10在腫瘤部位濃聚的變化有良好的相關(guān)性。張曉軍等[14]對(duì)6例腦轉(zhuǎn)移瘤患者放療后行18F-ML-10顯像結(jié)果顯示，其可用于顱腦轉(zhuǎn)移瘤患者放療后的凋亡評(píng)價(jià)。上述研究是關(guān)于顱腦腫瘤經(jīng)放療后，腫瘤組織的18F-ML-10攝取量與細(xì)胞凋亡具有一定的相關(guān)性。腫瘤組織經(jīng)化療后，利用18F-ML-10 PET/CT顯像評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞凋亡程度及療效判定的相關(guān)研究較少，本實(shí)驗(yàn)是對(duì)其的一種嘗試。實(shí)驗(yàn)樣本量較少，而且研究對(duì)象非人體，因此還需進(jìn)一步深入研究。隨著研究的不斷深入，18F-ML-10 PET/CT顯像應(yīng)用于評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞凋亡將發(fā)揮更加重要的作用。