楊 振，謹(jǐn) 瑾，馬小雨，代 科，王正皓，曹三杰，黃小波，伍 銳，趙 勤，文翼平

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心，成都 611130)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)為革蘭陰性菌，屬于巴氏桿菌科(Pasteurellaceae)，無運(yùn)動性，多形態(tài)[1-2]，主要引起豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎[3]。隨著豬場的規(guī)?；?、集約化發(fā)展，副豬嗜血桿菌病給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]，近年來國內(nèi)外對于HPS的研究愈來愈熱。在對HPS毒力因子、信號通路及致病機(jī)制等的相關(guān)研究中，常采用自然轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建基因缺失株和回補(bǔ)株以用于研究相關(guān)基因編碼的蛋白功能[5]。

細(xì)菌將遺傳物質(zhì)從親代傳遞給子代的過程稱作基因的縱向轉(zhuǎn)移(vertical transfer)。此外，細(xì)菌通過另一種基因傳遞方向——平行基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer，HGT)來實現(xiàn)遺傳物質(zhì)水平方向的交流。HGT被認(rèn)為促進(jìn)了細(xì)菌基因組的可塑性，使細(xì)菌可以有效地適應(yīng)環(huán)境中的改變而獲得一個更廣泛的生存空間，在細(xì)菌進(jìn)化過程中扮演了重要角色[6]。接合轉(zhuǎn)移(conjugation)、轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)和自然轉(zhuǎn)化(natural transformation)作為細(xì)菌平行基因轉(zhuǎn)移的三種模式[7]，在耐藥性的傳播、編碼毒素噬菌體的分布以及致病島(pathogenicity islands)的轉(zhuǎn)移等過程中都發(fā)揮著重要作用[8-9]。在自然條件下，細(xì)菌主動攝取外源DNA并將其穩(wěn)定遺傳的過程稱作自然轉(zhuǎn)化[10]。自1928年Griffith首次發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的自然轉(zhuǎn)化過程后，陸續(xù)有許多細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)具有自然轉(zhuǎn)化能力，這些細(xì)菌被稱作自然感受態(tài)細(xì)菌(naturally competent bacteria)[11-12]。

HPS同樣展現(xiàn)出了自然轉(zhuǎn)化的能力[5]。自2004年Bigas等[13]以該菌自然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為基礎(chǔ)，創(chuàng)建了一套在HPS上的基因操作技術(shù)，借此構(gòu)建該菌的基因缺失株來研究相關(guān)基因功能，HPS自然轉(zhuǎn)化的應(yīng)用便推廣開來。與接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，自然轉(zhuǎn)化的發(fā)生很少受到外源DNA的影響及轉(zhuǎn)化方法的局限，如感受態(tài)細(xì)菌的制備。自然轉(zhuǎn)化只與受體菌的誘導(dǎo)相關(guān),且操作相對簡單[14]。研究表明，自然轉(zhuǎn)化的發(fā)生是很多基因精密調(diào)控的結(jié)果，包括作為核心調(diào)控因子的tfox(Sxy)、crp、cyaA，以及作為DNA攝取和同源重組的組件結(jié)構(gòu)的dprA、rec2、四型菌毛系統(tǒng)(pilA、pilB、pilC、pilD、pilF)及comABCD操縱子等[15]。不同細(xì)菌，尤其是革蘭陰性菌的自然轉(zhuǎn)化能力的系統(tǒng)性調(diào)控存在著很大差異，使自然轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究變得更加困難[14]。近年來，許多研究者采用自然轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建基因缺失株對相關(guān)基因功能進(jìn)行研究，例如周鵬[16]構(gòu)建了HAPS_RS00465基因缺失株探究其在HPS生物被膜形成、生長速度方面的功能。然而關(guān)于HPS自然轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究鮮有報道，對于HPS自然轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究通過對實驗室鑒定和保存的HPS田間分離株及15株標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)一株高自然轉(zhuǎn)化效率的菌株(SC1401)，并對該菌株進(jìn)行了全基因組測序，分析其基因組特征，以親緣關(guān)系相對較近，且自然轉(zhuǎn)化機(jī)制研究相對全面的流感嗜血桿菌Rd KW20菌株[17]的自然感受態(tài)相關(guān)調(diào)控基因為參考，初步挖掘SC1401中與自然轉(zhuǎn)化機(jī)制相關(guān)的基因，為后續(xù)進(jìn)一步研究HPS自然轉(zhuǎn)化機(jī)制提供生物材料，并奠定一定的分子背景基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

HPS田間分離株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心分離、鑒定并保存；HPS 15個血清型的標(biāo)準(zhǔn)株由澳大利亞Yeerongpilly動物研究中心細(xì)菌學(xué)實驗室惠贈，并由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心保存；質(zhì)粒cheYLKR-pK18由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心構(gòu)建和保存；分型血清由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心制備、鑒定并保存；胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購自美國BD公司；LA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、小牛血清購自Gibco公司；NAD、cAMP、卡那霉素、質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌總DNA提取試劑盒購自天根公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

參照何綠琴等[18]構(gòu)建cheY基因缺失株所用引物，及文獻(xiàn)[19]中用于HPS分子分型引物，合成本研究涉及的所有引物(表1)。HPS、Kan、cheY引物用于親本株、缺失株的鑒定；其余引物用于HPS血清型的鑒定。

表1本研究所用的引物序列

Table1Primersusedinthisstudy

基因Gene上游引物序列(5′→3′)Forward primer sequence下游引物序列(5′→3′)Reverse primer sequence長度/bpLengthHPSGTGATGAGGAAGGGTGGTGTGGCTTCGTCACCCTCTGT822KanGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCGGTCGGTCATTTCGAACCCC935cheYATGCGTATTTTATTAATTGAAGTTAAGCAACTTCATCGTTTTTTC672funB (serovar 1)CTGTGTATAATCTATCCCCGATCATCAGCGTCCAACAGAATTTGGACCAATTCCTG180wzx (serovar 2)CTAACAAGTTAGGTATGGAGGGTTTTGGTGGGCACTGAATAAGGGATAATTGTACTG295glyC (serovar 3)CATGGTGTTTATCCTGACTTGGCTGTTCCACATGAGGCCGCTTCTAATATACT750wciP (serovar 4)GGTTAAGAGGTAGAGCTAAGAATAGAGGCTTTCCACAACAGCTCTAGAAACC320wcwK(serovar 5 or 12)CCACTGGATAGAGAGTGGCAGGCCATACATCTGAATTCCTAAGC450gltI (serovar 6)GATTCTGATGATTTTTGGCTGACGGAACGCCTATTCTGTCTATAAGCATAGACAGGAC360funQ (serovar 7)CTCCGATTTCATCTTTTCTATGTGGCGATAAACCATAACAATTCCTGGCAC490scdA (serovar 8)GGAAGGGGATTACTACTACCTGAAAGCTCCATAGAACCTGCTGCTTGAG750funV (serovar 9)AGCCACATCAATTTTAGCCTCATCACCTTAAATAGCCTATGTCTGTACC710funX (serovar 10)GGTGACATTTATGGGCGAGTAAGTCGCACTGTCATCAATAACAATCTTAAGACG790amtA (serovar 11)CCATCTCTTTAACTAATGGGACTGGGACGCCAAGGAGTATTATCAAATG890gltP (serovar 13)GCTGGAGGAGTTGAAAGAGTTGTTACCAATCAAATGAAACAACAGGAAGC840funAB(serovar 14)GCTGGTTATGACTATTTCTTTCGCGGCTCCCAAGATTAAACCACAAGCAAG730funI (serovar 15)CAAGTTCGGATTGGGAGCATATATCCCTATATCATTTGTTGGATGTACG550

1.3 高自然轉(zhuǎn)化效率菌株的篩選

1.3.1 自然感受態(tài)細(xì)菌的篩選 使用cheYLKR-pK18質(zhì)粒對實驗室保存的75株HPS田間分離株和15株標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行自然感受態(tài)細(xì)菌的初步篩選，具體操作參考謹(jǐn)瑾等[20]確定的HPS自然轉(zhuǎn)化最優(yōu)條件：將受體菌挑單至3 mL TSB液體培養(yǎng)基(添加5%小牛血清和0.01%NAD, TSB++)中，37 ℃ 搖床培養(yǎng)14 h；取出后將菌液點在TSA固體培養(yǎng)基中(添加5%小牛血清和0.01%NAD, TSA++)平板上，使其分散成直徑約為10 mm的圓形斑點，37 ℃培養(yǎng)13 h。用30 μL TSB++重懸菌苔，以調(diào)整菌液濃度到5×1010CFU·mL-1；取20 μL 重懸液，加入1 μg的外源質(zhì)粒cheYLKR-pK18(使用等體積的TE buffer做陰性對照[13])，混勻后37 ℃孵育10 min；將混合液(約30 μL)點在TSA++平板上，使其形成10 mm左右的圓斑，37 ℃ 培養(yǎng)箱中孵育5 h；收集菌體，用100 μL TSB++重懸，涂于含50 μg·mL-1卡那霉素的TSA++平板，37 ℃孵育36～48 h后，對抗性平板上生長的菌落進(jìn)行PCR鑒定以確定自然轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

1.3.2 自然轉(zhuǎn)化效率的測定 測定初步篩選為自然感受態(tài)的田間分離株的轉(zhuǎn)化效率，具體操作如下：前期操作同上，得到用100 μL TSB++重懸的菌苔后，37 ℃孵育5 h，再使用900 μL生理鹽水將重懸液進(jìn)行10倍等比稀釋。取100 μL 10-4稀釋的菌液涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的TSA++平板，取100 μL 10-7稀釋的菌液涂布于不含任何抗生素的TSA++平板，37 ℃孵育36～48 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，參考文獻(xiàn)中的計數(shù)方法[21-22]，計算各菌株的自然轉(zhuǎn)化效率(轉(zhuǎn)化效率=陽性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量/質(zhì)粒的量)，使用與外源質(zhì)粒等體積的TE buffer作為陰性對照。

1.4 各自然感受態(tài)菌株血清型的測定

根據(jù)已報道的HPS PCR分型方法[19]操作，引物如表1所示，PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃復(fù)性30 s，68 ℃延伸60 s，30個 循環(huán)；68 ℃延伸5 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定。

1.5 全基因組測序

1.5.1 DNA的提取 挑取“1.3”中所得自然轉(zhuǎn)化效率最高的菌株單菌落于TSB++培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)16 h。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 基因組測序、組裝及注釋 基因組DNA提取后，進(jìn)行質(zhì)量鑒定，在純度和濃度均達(dá)到測序要求后進(jìn)行全基因組測序?；蚪M的測序采用PacBio三代測序技術(shù)，構(gòu)建10 kb SMRTbell DNA文庫，測序深度為180×。并基于Linux系統(tǒng)平臺，利用C語言、C++語言、perl語言以及相應(yīng)程序、腳本等，開發(fā)適用于Haemophilusparasuis基因組分析的軟件BacCompMap-Haemophilusparasuis-WYP，在評估其有效性后，對SC1401基因組進(jìn)行denovo組裝和分析。使用GeneMarks對拼接好的SC1401基因組進(jìn)行基因功能的預(yù)測。為了預(yù)測編碼蛋白的基因，將全基因組與包括KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)、COG(Clusters of orthologous groups)、NR(非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫)、Swiss-Prot、GO(Gene ontology)和TrEMBL在內(nèi)的六個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。使用RNAmmer和tRNAscan-SE軟件分別進(jìn)行rRNA和tRNA的預(yù)測。

1.5.3 全基因組序列的上傳與比較基因組學(xué)分析 將 所得菌株的全基因組序列上傳GenBank、EMBL、DDBJ數(shù)據(jù)庫中。將該菌株與其他四株完成全基因組測序的副豬嗜血桿菌基因組序列進(jìn)行比較分析，包括SH0165株(GenBank：CP001321)、SH03株(GenBank：CP009158)、KL0318株(GenBank：CP009237)和ZJ0906株(GenBank：CP005384)。四個菌株的全基因組序列及注釋信息均來自GenBank數(shù)據(jù)庫。比較五株菌株基因組的基本特征，并使用Mauve軟件進(jìn)行基因組共線性分析。

1.5.4 自然轉(zhuǎn)化相關(guān)基因分析 目前自然轉(zhuǎn)化機(jī)制在流感嗜血桿菌中研究的較為透徹，且流感嗜血桿菌與副豬嗜血桿菌為親緣關(guān)系相近，同屬于巴斯德菌屬。將試驗所得菌株的測序結(jié)果與流感嗜血桿菌Rd KW20菌株進(jìn)行比對，分析HPS中存在的與自然轉(zhuǎn)化可能相關(guān)的基因，并與“1.5.3”中提到的四株完成全基因組測序的HPS進(jìn)行比對。

2 結(jié) 果

2.1 高自然轉(zhuǎn)化效力菌株的篩選

使用HPS-F/R檢測，親本株與缺失株均產(chǎn)生目的條帶，大小為 822 bp；使用引物cheY-F/R檢測，親本株有條帶，大小為 672 bp，缺失株無條帶；使用引物Kan-F/R檢測，親本株無條帶，缺失株產(chǎn)生條帶，大小為935 bp(圖1)，證明該菌株為自然感受態(tài)細(xì)菌。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、4.引物HPS-F/R鑒定；2、5.引 物cheY-F/R鑒定；3、6.引物Kan-F/R鑒定；1～3.親本菌；4～6.突變株
M. DNA marker; 1, 4. Identification with primers HPS-F/R；2, 5. Identification with primers cheY-F/R; 3, 6. Identification with primers Kan-F/R; 1-3. SC1401; 4-6. SC1401 ΔcheY::kan
圖1 cheY缺失株的PCR鑒定
Fig.1 Identification of the mutant strain SC1401 ΔcheY::kan by PCR

對本實驗室75株HPS田間分離株及15株標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行篩選，共得到11株自然感受態(tài)細(xì)菌，并測得各菌株的自然轉(zhuǎn)化效率。菌株名稱及自然轉(zhuǎn)化效率如表2所示。其中自然轉(zhuǎn)化效率最高的菌株為SC1401。

2.2 自然感受態(tài)細(xì)菌血清型的鑒定

使用表1中的分型引物對所得自然感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行血清分型，根據(jù)產(chǎn)生特異性條帶的引物及目的條帶大小判斷菌株的血清型，結(jié)果如表2所示。

表2自然感受態(tài)菌株的血清型及其轉(zhuǎn)化效率

Table2Serotypeandtransformationefficiencyofnaturalcompetence

菌株編號Strain name血清型Serotype轉(zhuǎn)化效率Transformation efficiencySC1401S11(4.3±0.2)×104EP3S13(3.3±0.2)×104XJ3103S13(2.2±0.6)×104GA5140S11(8.9±0.7)×103XJ3105S13(4.2±0.8)×103MX1208S4(4.0±0.5)×103YA0301S13(6.3±0.2)×102HLJ0402S5(3.3±0.6)×102YB1901S5(7.6±0.2)×101MX1201S4(4.0±0.5)×101XJ3106S1(3.2±0.7)×101

2.3 基因組組裝與注釋

本研究獲得完整的副豬嗜血桿菌SC1401基因組序列，序列全長2 277 540 bp，其GC含量為40.03%，共編碼2 220個基因，其占整個基因組序列的87.75%。將其基因組基本信息與其他四株完成全基因組測序的HPS菌株——SH0165株、SH03株、KL0318株和ZJ0906株進(jìn)行比較，結(jié)果如表3所示。

表35株副豬嗜血桿菌全基因組比較

Table3Genomecomparisonof5HPSstrains

菌株編號Strain No.基因組大小/MbSize基因GeneGC含量/%GC%rRNAtRNA其他RNAOther RNA蛋白質(zhì)Protein假基因PseudogeneSC14012.282 22040.0195941 971167SH01652.272 27340.0205642 050143SH032.272 29740.0195942 028187KL03182.282 29640.0205642 023193ZJ09062.322 23540.61563-2 211-

2.4 比較基因組學(xué)分析

5株副豬嗜血桿菌基因組的基本特征如表3所示，各菌株在基因組大小、GC含量方面非常相似，在編碼蛋白質(zhì)的數(shù)量、RNA數(shù)量以及基因總數(shù)方面存在一些差異，表明各菌株在進(jìn)化階段存在一定的差異，在進(jìn)化過程中丟失或新獲取了一些基因。將SC1401菌株編碼的所有基因與其余四株進(jìn)行比對(圖2)，發(fā)現(xiàn)1 412個基因為5個菌株共有，385個基因為SC1401菌株特有，SH0165、SH03、KL0318及ZJ0906特有的基因數(shù)量分別為190、47、71、201個。

采用Mauve軟件將SC1401全基因組與其余四株菌株的基因組進(jìn)行比對分析，比對結(jié)果見圖3。從圖中可以看到SC1401菌株與其余四株菌株相似性較高，有著非常保守的基因組結(jié)構(gòu)和共線性關(guān)系。

圖2 core-pan基因分析
Fig.2 Analysis of core-pan gene

2.5 自然轉(zhuǎn)化相關(guān)基因

將SC1401菌株序列與流感嗜血桿菌Rd KW20菌株序列比對后，得到多個與自然轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因(圖4)。圖4中各個基因同樣均存在于SH0165、SH03、KL0318和ZJ0906菌株中。在SC1401中，comABCDE共用一個操縱子，pilABCD共用一個操縱子。

3 討 論

比起人工制作的感受態(tài)細(xì)菌(電化學(xué)方法)，自然轉(zhuǎn)化是細(xì)菌在天然狀態(tài)下的轉(zhuǎn)化情形，人們根據(jù)HPS的這種特性，創(chuàng)建了相應(yīng)的基因缺失的方法，用以研究該菌的基因功能[13]。比起電轉(zhuǎn)化和接合轉(zhuǎn)移，該方法無需對親本株進(jìn)行特殊處理，操作更簡單，試驗周期短，更易獲得陽性轉(zhuǎn)化子。因此，該方法很快便得到推廣與使用，尤其在研究基因功能和毒力因子方面。然而并非所有副豬嗜血桿菌都是自然感受態(tài)細(xì)菌，因此篩選HPS自然感受態(tài)菌株也為HPS基因功能研究提供了生物材料，且在實際操作中，自然轉(zhuǎn)化效率往往很低，獲得正確的陽性克隆子往往需要反復(fù)試驗，延長了試驗周期。

CheY/QseC屬于HPS的一對二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，CheY負(fù)責(zé)調(diào)控特定基因的表達(dá)水平，屬于細(xì)胞質(zhì)應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，cheY對于HPS至關(guān)重要，且在HPS中高度保守，此前何綠琴等[18]成功使用自然轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建出HPScheY基因缺失株，因此本研究通過cheY LKR-pK18來篩選自然感受態(tài)細(xì)菌，其原理和方法大致如下：通過overlap-PCR將cheY基因上游同源臂L、下游同源臂R和卡那霉素抗性盒Kan融合成cheYLKR片段；將此片段連接至pK18mobsacB自殺質(zhì)粒得到cheY LKR-pK18質(zhì)粒；利用同源重組原理及自然轉(zhuǎn)化法將該質(zhì)粒上的Kan轉(zhuǎn)化到HPS中置換cheY原位基因以獲得具有卡那霉素抗性的cheY突變菌株。

本研究在75株田間分離株中共篩出11株自然感受態(tài)細(xì)菌，包括高自然轉(zhuǎn)化效率的SC1401菌株，說明自然感受態(tài)細(xì)菌在田間分離株中占有一定的比例，而15株標(biāo)準(zhǔn)株均未檢測到自然轉(zhuǎn)化的發(fā)生，可能是由于其自身本就不具備自然轉(zhuǎn)化能力，或者目前未能摸索到有效誘導(dǎo)其自然轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件。

通過全基因組測序，我們獲得了高自然轉(zhuǎn)化效率菌株SC1401的基因組序列，并上傳到GenBank、EMBL、DDBJ數(shù)據(jù)庫中，登錄號為CP015099。將SC1401菌株與其他四株完成全基因組測序的副豬嗜血桿菌基因組序列進(jìn)行比較分析，包括SH0165株、SH03株、KL0318株和ZJ0906株。

圖3 SC1401與其余4株菌株的共線性分析
Fig.3 Syntenic analysis between SC1401 and the other 4 strains

圖4 5株副豬嗜血桿菌菌株與自然轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因
Fig.4 Genes related to natural transformation of 5 HPS strains

分析表明SC1401菌株基因組的基本特征與其他HPS屬的菌株基因組的共線性關(guān)系較好，但core-pan基因分析表明各菌株亦存在一定的差異，其中SC1401菌株特有的基因高達(dá)385個，而SH0165、SH03、KL0318及ZJ0906特有的基因數(shù)量則分別為190、47、71、201個，遠(yuǎn)低于SC1401所含有的特有基因數(shù)量。該現(xiàn)象可能是由于SC1401具備高自然轉(zhuǎn)化效率，在進(jìn)化的歷程中更容易獲得外源基因所導(dǎo)致的。

在之前自然感受態(tài)細(xì)菌篩選的過程中，各個菌株的自然轉(zhuǎn)化能力存在明顯的差別。通過驗證尚未發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌參考菌株SH0165具備自然轉(zhuǎn)化能力，SH03、KL0318和ZJ0906菌株尚無關(guān)于自然轉(zhuǎn)化的報道，自然轉(zhuǎn)化能力未知。然而序列比對發(fā)現(xiàn)，SH0165、SH03、KL0318和ZJ0906菌株與SC1401菌株基因組均存在與自然轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因(圖3)：負(fù)責(zé)自然轉(zhuǎn)化過程中DNA攝取的com系統(tǒng)和T4P四型菌毛系統(tǒng)，負(fù)責(zé)細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化調(diào)控的crp、cyaA、icc和tfox基因，與重組或DNA程序化進(jìn)程(生理生化進(jìn)程)有關(guān)的comM、dprA、radc、recA、ssb基因，以及在自然轉(zhuǎn)化過程中功能未知的ligA、murE、luxS和rbsB基因。

通過比對發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)基因在二者間的一致性都高達(dá)90%以上，而tfox基因一致性只為74%(該基因在多種細(xì)菌中已被證實是自然轉(zhuǎn)化上游核心調(diào)控因子)，這提示二者自然轉(zhuǎn)換能力的不同可能是由于各基因轉(zhuǎn)錄水平/表達(dá)差異以及/或tfox基因的分子差異造成的，亦有可能副豬嗜血桿菌中還存在其他未知的與自然轉(zhuǎn)化相關(guān)的重要基因/分子基礎(chǔ)。研究表明流感嗜血桿菌的感受態(tài)建立受到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子tfox和cAMP受體蛋白CRP共同調(diào)控(cAMP-CRP復(fù)合物)，tfox缺失株失去了自然轉(zhuǎn)化的能力，而tfox表達(dá)上調(diào)的突變株能夠進(jìn)行持續(xù)性的自然轉(zhuǎn)化[21]。由于tfox基因在副豬嗜血桿菌高、低自然感受態(tài)細(xì)菌中具有明顯的分子差異，而在流感嗜血桿菌、大腸桿菌等中高度保守(相似度達(dá)95%以上)，且該基因作為自然感受態(tài)系統(tǒng)的核心調(diào)控元件，其在HPS中的后續(xù)研究則很有必要。同時SH0165與SC1401菌株自然轉(zhuǎn)化能力的差異及基于此差異背后的分子背景的挖掘，為筆者后續(xù)開展HPS自然轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

Bossé等[23]在篩選傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)的自然感受態(tài)菌株時，所檢測的血清3型菌株均具有自然轉(zhuǎn)化能力，而血清7型菌株均未檢測到自然轉(zhuǎn)化能力。本研究篩選出的11株自然感受態(tài)細(xì)菌的分型結(jié)果顯示：血清13型4株，血清4型、5型、11型各2株，血清1型1株。在HPS中，自然轉(zhuǎn)化能力與血清型之間的關(guān)系目前未見報道，二者之間是否像在APP中一樣存在一定關(guān)聯(lián)，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

篩選出11株HPS自然感受態(tài)菌株，均為野生型，其中SC1401菌株自然轉(zhuǎn)化效率最高；SC1401菌株基因組大小為2 277 540 bp，GC含量為40.03%，共編碼2 220個基因；基因組共線性分析表明SC1401與其他4株(SH0165、SH03、KL0318和ZJ0906株)全基因組測序菌株的共線性良好；比較基因組分析表明，SC1401菌株含特有基因385個，多于其他4株；5株HPS含有一系列相同的與自然轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因，且除tfox基因外，各基因氨基酸序列一致性均達(dá)90%以上。