鄧珊珊，高洪波,2，袁 超,2，趙佳福,2，倪萌萌,2，段志強(qiáng),2*，嵇辛勤,2*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025； 2.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550025)

細(xì)胞基質(zhì)蛋白3(matrin 3, MATR3)是最早報(bào)道的12種主要核基質(zhì)蛋白之一，在不同細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)且高度保守[1-2]。MATR3蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為125 ku，有四個(gè)明顯的功能結(jié)構(gòu)域，包括兩個(gè)可結(jié)合RNA的RNA識(shí)別基序(RNA recognition motif type, RRM)和兩個(gè)可結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc-finger domains, ZF)，另外還存在幾個(gè)酪氨酸或絲氨酸/蘇氨酸激酶的磷酸化位點(diǎn)[3-5]。大量的研究表明，MATR3蛋白主要定位在細(xì)胞核，在細(xì)胞內(nèi)參與了細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、mRNA前體的剪接和穩(wěn)定、DNA損傷修復(fù)以及細(xì)胞增殖等活動(dòng)[6]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，MATR3蛋白在逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的核輸出、基因組的穩(wěn)定性和表達(dá)調(diào)控等方面也具有重要作用[7-8]。一般來說，相對(duì)分子質(zhì)量小于50 ku的蛋白質(zhì)可以通過自由擴(kuò)散或被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞核，而相對(duì)分子質(zhì)量大于50 ku的蛋白質(zhì)只能通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，其序列中必須存在核定位信號(hào)(nuclear localization signal, NLS)，并且被相應(yīng)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白識(shí)別和結(jié)合后才能將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核[9-11]。雞MATR3蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于50 ku，但是目前其攜帶的NLS以及入核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不清楚。因此，本研究首先通過核定位信號(hào)在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)雞MATR3蛋白中存在的假定NLS(putative NLS, pNLS)，然后構(gòu)建pNLS缺失體重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后觀察重組蛋白的亞細(xì)胞定位來確定雞MATR3蛋白NLS。同時(shí)，構(gòu)建雞MATR3蛋白NLS鄰近堿性氨基酸缺失的重組真核表達(dá)載體，通過觀察重組蛋白的亞細(xì)胞定位來判斷鄰近堿性氨基酸位點(diǎn)是否參與了NLS介導(dǎo)的雞MATR3蛋白細(xì)胞核定位。另外，將鑒定的雞MATR3蛋白NLS與紅色熒光蛋白融合表達(dá)觀察其對(duì)外源蛋白的核輸入情況，確定雞MATR3蛋白NLS的核輸入能力。這些研究將為進(jìn)一步鑒定雞MATR3蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白，闡明其細(xì)胞核定位的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒

HEK-293T細(xì)胞、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、真核表達(dá)載體pDsRed1-C1和雞MATR3基因重組克隆質(zhì)粒pMD19T-MATR3[12]由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

pfuTaqDNA高保真聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA marker、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamH Ⅰ購(gòu)自Thermo Fisher公司；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自AxyGen公司；TransIT?-2020 Transfection Reagent購(gòu)自Mirusbio公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Qiangen公司；DNA寡核苷酸退火緩沖液(Annealing Buffer for DNA Oligo 5×)、4%多聚甲醛和Triton X-100購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；卡那霉素、細(xì)胞核染料DAPI購(gòu)自Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 雞MATR3蛋白NLS的預(yù)測(cè)

利用蛋白質(zhì)NLS在線預(yù)測(cè)軟件PSORT Ⅱ(https://www.genscript.com/psort.html)對(duì)雞MATR3蛋白中存在的假定NLS進(jìn)行預(yù)測(cè)，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)pNLS(表1)。

1.4 雞MATR3蛋白pNLS缺失體重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中登錄的雞MATR3基因序列(登錄號(hào)：NM_204147)，利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增雞MATR3基因pNLS缺失體(圖1)的特異性引物(表2)，上游引物加XhoⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物加BamHⅠ酶切位點(diǎn)(酶切位點(diǎn)用下劃線斜體標(biāo)出)，引物由上海Invitrogen公司合成。以重組克隆質(zhì)粒pMD19T-MATR3為模板，用特異性引物(圖2)進(jìn)行PCR分段擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和純化后，再用上下游引物F/R進(jìn)行overlap PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和純化后，將PCR產(chǎn)物和pDsRed1-C1真核表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切，膠回收目的片段后進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海Invitrogen公司測(cè)序。

表1雞MATR3蛋白假定NLS的預(yù)測(cè)

Table1PredictionoftheputativeNLSinchickenMATR3

a.從MATR3蛋白的第一個(gè)氨基酸開始

a. Start with the first amino acid of MATR3 protein

1.5 雞MATR3蛋白NLS鄰近堿性氨基酸缺失的重組真核表達(dá)載體構(gòu)建

由于雞MATR3蛋白NLS附近存在多個(gè)堿性氨基酸位點(diǎn)，為了驗(yàn)證其對(duì)NLS介導(dǎo)的雞MATR3蛋白核定位是否有影響，筆者分別設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的DNA寡核苷酸引物(表3)將MATR3蛋白NLS鄰近堿性氨基酸位點(diǎn)缺失。

圖1 雞MATR3蛋白pNLS缺失體結(jié)構(gòu)
Fig.1 The schematic diagram of chicken MATR3 pNLS deletants

表2構(gòu)建雞MATR3蛋白pNLS缺失體重組質(zhì)粒所用引物

Table2PrimersusedtoconstructtherecombinantplasmidsofchickenMATR3withthepNLSdeletion

重組質(zhì)粒Recombinant plasmid引物Primer引物序列(5′→3′)aPrimer sequence (5′→3′)退火溫度/℃Tm片段大小/bpSizeFATACTCGAGCAATGTCCAAGTCATTCCAGCAGTCATCTpDsRed-MATR3(△pNLS1)a1b1CCTTCTTCAGCAAGTTGTAGAAGGATCTGAGGCCTTCTACAACTTGCTGAAGAAGGTTATGG602 697pDsRed-MATR3(△pNLS2)a2b2GTAGCATCAGTAGAGTCTTTACTGTCTGCAGTAAAGACTCTACTGATGCTACTCAGAAGCC602 688pDsRed-MATR3(△pNLS3)a3b3CGTATCGCTTTTTATTGGCCACAACATTTCCTGTTGTGGCCAATAAAAAGCGATACGTGGG602 688pDsRed-MATR3a4CTTGGATCCTCAATCTTCATTTGTGTAGAACAGGG602 610(△pNLS4)RTCAGGATCCTTATGCTTCTTTCTTTTGCCTGTAGTC

a. 限制性酶切位點(diǎn)以斜體和下劃線方式表示

a. Restriction sits are given in italics and underlines

圖2 雞MATR3蛋白pNLS缺失體基因PCR擴(kuò)增引物示意
Fig.2 The schematic diagram of primers used for the amplification of chicken MATR3 genes with the pNLS deletion

表3構(gòu)建雞MATR3蛋白NLS鄰近堿性氨基酸缺失重組質(zhì)粒所用引物

Table3PrimersusedtoconstructtherecombinantplasmidscarryingthedeletionofadjacentbasicaminoacidsinchickenMATR3NLS

重組質(zhì)粒Recombinant plasmid引物Primer引物序列(5′→3′)aPrimer sequence (5′→3′)pDsRed-MATR3/M1F1R1TCGAGCTAACAAAGGAGTTGAACTTCTGAAAAAGGATAAAACTAGGAAGA-GAACATATTCTCCAGACAGTAAAGACTCTCCAAGTGATAAGAAGTCTAAGGGATCCCTTAGACTTCTTATCACTTGGAGAGTCTTTACTGTCTGGAGAATAT-GTTCTCTTCCTAGTTTTATCCTTTTTCAGAAGTTCAACTCCTTTGTTAGCpDsRed-MATR3/M2F2R2TCGAGCTAACAAAGGAGTTGAACTTCTGAAAAAGGATAAAACTAGGAAG-AGAACATATTCTCCAGACAGTAAAGACTCTGGATCCAGAGTCTTTACTGTCTGGAGAATATGTTCTCTTCCTAGTTTTATC-CTTTTTCAGAAGTTCAACTCCTTTGTTAGCpDsRed-MATR3/M3F3R3TCGAGCTAACAAAGGAGTTGAACTTCTGAAAAAGGATAAAACTAGGAAG-AGAACATATCCAAGTGATAAGAAGTCTAAGGGATCCCTTAGACTTCTTATCACTTGGATATGTTCTCTTCCTAGTTTTATCC-TTTTTCAGAAGTTCAACTCCTTTGTTAGCpDsRed-MATR3/M4F4R4TCGAGCTAACAAAGGAGTTGAACTTCTGAAAAAGGATAAATATTCTCCA-GACAGTAAAGACTCTCCAAGTGATAAGAAGTCTAAGGGATCCCTTAGACTTCTTATCACTTGGAGAGTCTTTACTGTCTGGAGAATA-TTTATCCTTTTTCAGAAGTTCAACTCCTTTGTTAGCpDsRed-MATR3/M5F5R5TCGAGCTAACAAAGGAGTTGAACTTCTGACTAGGAAGAGAACATATTCTC-CAGACAGTAAAGACTCTCCAAGTGATAAGAAGTCTAAGGGATCCCTTAGACTTCTTATCACTTGGAGAGTCTTTACTGTCTGGAGAATAT-GTTCTCTTCCTAGTCAGAAGTTCAACTCCTTTGTTAGCpDsRed-MATR3/M6F6R6TCGAGCTGTTGAACTTCTGAAAAAGGATAAAACTAGGAAGAGAACATAT-TCTCCAGACAGTAAAGACTCTCCAAGTGATAAGAAGTCTAAGGGATCCCTTAGACTTCTTATCACTTGGAGAGTCTTTACTGTCTGGAGAATA-TGTTCTCTTCCTAGTTTTATCCTTTTTCAGAAGTTCAACAGCpDsRed-SV40/NLSFRTCGAGCTGCCACCATGTGTGGTGGAGGGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG-AAGACGAAGCTTCGTCTTCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGCCCTCCACCACACATGGTG-GCAGC

a. 限制性酶切位點(diǎn)以斜體和下劃線方式表示

a. Restriction sits are given in italics and underlines

設(shè)計(jì)的引物兩端分別帶有XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)便于插入相應(yīng)的載體，引物由上海Invitrogen公司合成。使用DNA寡核苷酸退火緩沖液將相應(yīng)的上下游引物連接形成雙鏈DNA，然后將其與經(jīng)過同樣雙酶切的pDsRed1-C1真核表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將電泳檢測(cè)結(jié)果為陽性的重組質(zhì)粒送上海Invitrogen公司測(cè)序。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HEK-293T細(xì)胞使用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，按5×105cells·well-1的量將消化后的HEK-293T細(xì)胞鋪在35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)至80%左右，更換細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，然后將純化的重組真核表達(dá)載體和脂質(zhì)體(比例為2.5 μg∶10 μL)先后加入到250 μL無抗無血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻后室溫靜置25 min，最后加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.7 重組蛋白的熒光觀察

重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后24 h， PBS洗滌細(xì)胞3次，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定20 min；棄掉液體，PBS洗滌3次，加入0.25% TritonX-100室溫作用5 min；PBS洗滌3次，加入DAPI染細(xì)胞核10 min；PBS洗滌3次后，于熒光顯

微鏡下觀察重組蛋白的熒光表達(dá)情況。將獲得的重組蛋白熒光定位圖片與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞核熒光圖片用Photoshop CS3軟件進(jìn)行Merge處理，通過熒光共定位來判斷重組蛋白的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié) 果

2.1 雞MATR3蛋白pNLS的預(yù)測(cè)

用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)軟件PSORT Ⅱ?qū)﹄uMATR3 蛋白進(jìn)行pNLS預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，雞MATR3 蛋白共有四個(gè)pNLS(表1)，分為兩種類型，分別是由單簇堿性氨基酸組成的單分型NLS：pNLS1(145KRRR148)、pNLS2(596PSDKKSK602)、pNLS3(706PATKKKL712)，以及兩簇堿性氨基酸組成的雙分型NLS：pNLS4(872KKTHCSSLPHYQKLKKI888)。

2.2 雞MATR3蛋白pNLS缺失體重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pMD19T-MATR3為模板，通過overlap PCR方法獲得雞MATR3蛋白pNLS缺失的基因片段，片段大小與預(yù)期大小相符(圖3A)。將其分別定向插入到真核表達(dá)載體pDsRed-C1多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pDsRed-MATR3(△pNLS1)、pDsRed-MATR3(△pNLS2)、pDsRed-MATR3(△pNLS3)和pDsRed-MATR3(△pNLS4)。對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，均可獲得載體片段和相應(yīng)大小的目的基因片段(圖3B)，將陽性的重組質(zhì)粒送上海Invitrogen公司測(cè)序。

A. Overlap PCR擴(kuò)增條帶[M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. MATR3(△pNLS1)基因；2. MATR3(△pNLS2)基因；3.MATR3(△pNLS3)基因；4. MATR3(△pNLS4)基因；5. MATR3基因]. B. 重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物[M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2. pDsRed-MATR3(△pNLS1)雙酶切產(chǎn)物；3、4. pDsRed-MATR3(△pNLS2)雙酶切產(chǎn)物；5、6. pDsRed-MATR3(△pNLS3)雙酶切產(chǎn)物；7、8. pDsRed-MATR3(△pNLS4)雙酶切產(chǎn)物；9. pDsRed-MATR3雙酶切產(chǎn)物]
A. Overlap PCR amplification products (M. DNA marker; 1. MATR3(△pNLS1) gene; 2. MATR3(△pNLS2) gene; 3. MATR3 (△pNLS3) gene; 4. MATR3(△pNLS4) gene; 5. MATR3 gene). B. Double enzyme digestion of the recombinant plasmids (M. DNA marker; 1, 2. pDsRed-MATR3(△pNLS1) enzyme digestion; 3, 4. pDsRed-MATR3(△pNLS2) enzyme digestion; 5, 6. pDsRed-MATR3(△pNLS3) enzyme digestion; 7, 8. pDsRed-MATR3(△pNLS4) enzyme digestion; 9. pDsRed-MATR3 enzyme digestion)
圖3 雞MATR3蛋白pNLS缺失體重組真核表達(dá)載體的鑒定
Fig.3 Identification of recombinant plasmids expressing the pNLS deletants of chicken MATR3

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明：雞MATR3基因全長(zhǎng)片段及其pNLS缺失體片段按正確的開放閱讀框插入到真核表達(dá)載體pDsRed1-C1，并且未發(fā)生基因突變，說明雞MATR3蛋白pNLS缺失體重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 雞MATR3蛋白NLS鄰近堿性氨基酸缺失的重組真核表達(dá)載體構(gòu)建

將雞MATR3蛋白NLS及其鄰近氨基酸位點(diǎn)缺失的序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的上下游引物，將其連接形成雙鏈DNA，與經(jīng)過雙酶切的pDsRed1-C1載體相連構(gòu)建重組真核表達(dá)載體，分別命名為pDsRed-MATR3/M1、pDsRed-MATR3/M2、pDsRed-MATR3/M3、pDsRed-MATR3/M4、pDsRed-MATR3/M5和pDsRed-MATR3/M6。提取質(zhì)粒后，將電泳檢測(cè)結(jié)果為陽性的重組質(zhì)粒(圖4)送上海Invitrogen公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，獲得了雞MATR3蛋白NLS及其鄰近氨基酸位點(diǎn)缺失的重組真核表達(dá)載體。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3. pDsRed-MATR3/M1重組質(zhì)粒；4～6. pDsRed-MATR3/M2重組質(zhì)粒；7～9. pDsRed-MATR3/M3重組質(zhì)粒；10～12. pDsRed-MATR3/M4重組質(zhì)粒；13～15. pDsRed-MATR3/M5重組質(zhì)粒；16～18. pDsRed-MATR3/M6重組質(zhì)粒
M.DNA marker; 1-3. pDsRed-MATR3/M1 recombinant plasmid; 4-6. pDsRed-MATR3/M2 recombinant plasmid; 7-9. pDsRed-MATR3/M3 recombinant plasmid; 10-12. pDsRed-MATR3/M4 recombinant plasmid; 13-15. pDsRed-MATR3/M5 recombinant plasmid; 16-18. pDsRed-MATR3/M6 recombinant plasmid
圖4 雞MATR3蛋白NLS鄰近堿性氨基酸缺失的重組真核表達(dá)載體鑒定
Fig.4 Characterization of the recombinant plasmids expressing the deletion of adjacent basic amino acids in chicken MATR3 NLS

2.4 雞MATR3蛋白pNLS缺失體重組蛋白的亞細(xì)胞定位

將成功構(gòu)建的雞MATR3蛋白pNLS缺失體重組真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h觀察重組蛋白的亞細(xì)胞定位情況。熒光觀察結(jié)果表明，DsRed-MATR3重組蛋白和pNLS缺失體重組蛋白DsRed-△pNLS1、DsRed-△pNLS3和DsRed-△pNLS4主要定位在細(xì)胞核，而DsRed-△pNLS2缺失體重組蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)，作為對(duì)照的空載體表達(dá)的DsRed則在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均存在(圖5)。以上結(jié)果說明，pNLS2缺失會(huì)影響雞MATR3蛋白的細(xì)胞核定位，因此pNLS2是決定雞MATR3蛋白細(xì)胞核定位的NLS。

2.5 雞MATR3蛋白NLS鄰近堿性氨基酸缺失體重組蛋白的亞細(xì)胞定位

對(duì)鑒定的雞MATR3蛋白NLS鄰近氨基酸位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，其前方存在多個(gè)堿性氨基酸位點(diǎn)。為了確定這些堿性氨基酸位點(diǎn)是否對(duì)雞MATR3蛋白核定位存在影響，筆者將構(gòu)建的雞MATR3蛋白NLS鄰近堿性氨基酸位點(diǎn)缺失體(圖6)重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察重組蛋白的亞細(xì)胞定位情況。熒光觀察結(jié)果顯示(圖6)：pDsRed-MATR3/M1、pDsRed-MATR3/M3、pDsRed-MATR3/M4、pDsRed-MATR3/M5和pDsRed-MATR3/M6重組蛋白主要定位在細(xì)胞核，而pDsRed-MATR3/M2重組蛋白和DsRed蛋白則在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均存在。以上結(jié)果表明，NLS鄰近堿性氨基酸位點(diǎn)不參與NLS介導(dǎo)的雞MATR3蛋白細(xì)胞核定位。

2.6 MATR3蛋白NLS的保守性分析及其核輸入能力檢測(cè)

從GenBank中下載雞、鴨等禽類以及人和鼠、豬和牛等哺乳動(dòng)物的MATR3蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MATR3蛋白NLS基序在人和不同動(dòng)物中保守，均為PSDKKSK(圖7)。SV40大T抗原NLS(126PKKKRKV132)是第一個(gè)鑒定的單分型NLS，同時(shí)也是一個(gè)能將外源蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核的NLS，具有很強(qiáng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)能力。筆者將構(gòu)建的pDsRed-SV40/NLS和pDsRed-MATR3/NLS重組真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察SV40/NLS和MATR3/NLS對(duì)紅色熒光蛋白的核輸入情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DsRed-SV40/NLS和DsRed-MATR3/NLS重組蛋白均主要表現(xiàn)為細(xì)胞核定位(圖7)，說明MATR3/NLS具有與SV40/NLS相同的核輸入能力。

3 討 論

MATR3蛋白是細(xì)胞核基質(zhì)蛋白重要成員之一，它可在不同的細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與了細(xì)胞核中的多種活動(dòng)，如形成細(xì)胞核骨架，與多種蛋白質(zhì)相互作用促進(jìn)DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)[13]以及維持mRNA 的穩(wěn)定性[14]等。

圖5 雞MATR3蛋白pNLS缺失的重組蛋白亞細(xì)胞定位
Fig.5 Subcellular localization of recombinant protein of chicken MATR3 pNLS deletants

圖6 雞MATR3蛋白NLS鄰近堿性氨基酸缺失體重組蛋白的亞細(xì)胞定位
Fig.6 The subcellular localization of adjacent basic amino acids deletants of chicken MATR3 NLS

最近研究發(fā)現(xiàn)，MATR3蛋白表達(dá)水平的改變與人類某些疾病密切相關(guān)，如MATR3蛋白表達(dá)水平降低或氨基酸發(fā)生突變與唐氏綜合征[15]、聲帶麻痹和肌萎縮性側(cè)索硬化[16-17]相關(guān)。除此之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)MATR3蛋白還參與了某些逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制增殖過程，如MATR3蛋白能結(jié)合人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus 1，HIV-1)基因組RNA，并且只有當(dāng)包含病毒基因組RNA的Rev蛋白應(yīng)答元件(Revresponse element, RRE)被MATR3蛋白結(jié)合時(shí)才能增強(qiáng)Rev蛋白的活性，而抑制細(xì)胞內(nèi)MATR3蛋白的表達(dá)則會(huì)降低Rev/RRE介導(dǎo)的未剪切HIV-1基因組RNA的核輸出，說明MATR3蛋白是增強(qiáng)HIV-1 Rev蛋白活性的細(xì)胞輔助因子，對(duì)HIV-1的復(fù)制和感染過程具有重要作用[7-8]。

圖7 MATR3蛋白NLS保守性分析及其核輸入能力檢測(cè)
Fig.7 Conservative analysis and nuclear import ability detection of MATR3/NLS

而MATR3蛋白參與動(dòng)物病毒復(fù)制和致病機(jī)制的研究方面目前尚未見報(bào)道。最近筆者課題組通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到雞MATR3蛋白與新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)基質(zhì)蛋白存在相互作用[18]。由于NDV感染細(xì)胞期間，其基質(zhì)蛋白可定位在細(xì)胞核，能抑制宿主細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[19]，筆者推測(cè)NDV基質(zhì)蛋白與MATR3蛋白互作抑制了MATR3蛋白在細(xì)胞核中的功能，這為后期深入探討雞MATR3蛋白在NDV復(fù)制和致病中的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

大量的研究證實(shí)，大分子蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核需要特定的NLS[20]。根據(jù)蛋白質(zhì)NLS組成特點(diǎn)可將NLS分為兩種類型[21]：一是由單簇堿性氨基酸(R或K)(包含2～10個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸)組成的單分型NLS和由兩簇堿性氨基酸(包含一段5～20個(gè)氨基酸殘基組成的間隔序列)組成的雙分型NLS，以上兩種NLS均屬于經(jīng)典NLS，二是由不單獨(dú)成簇堿性氨基酸(堿性氨基酸在組成上沒有明顯規(guī)律)組成的非經(jīng)典NLS。此外，研究還發(fā)現(xiàn)許多蛋白質(zhì)中可存在一個(gè)或多個(gè)NLS介導(dǎo)其細(xì)胞核定位[22]。在本研究中，筆者用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)雞MATR3蛋白有四個(gè)pNLS，分別是單簇堿性氨基酸組成單分型pNLS1、pNLS2和pNLS3，以及兩簇堿性氨基酸組成的雙分型pNLS4。但是通過pNLS缺失體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，僅pNLS2(596PSDKKSK602)是決定雞MATR3蛋白細(xì)胞核定位的關(guān)鍵NLS。有研究結(jié)果表明，NLS鄰近的堿性氨基酸可能在NLS介導(dǎo)的細(xì)胞核定位中發(fā)揮著輔助作用[23]。因此根據(jù)雞MATR3蛋白NLS及其鄰近堿性氨基酸序列構(gòu)建不同的重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對(duì)重組蛋白進(jìn)行熒光觀察和亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)雞MATR3 蛋白NLS鄰近的堿性氨基酸不參與NLS介導(dǎo)的MATR3蛋白細(xì)胞核定位。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)該NLS基序在不同物種MATR3蛋白中均保守，并且與SV40/NLS具有相同的核輸入能力。因此，本研究確定雞MATR3蛋白中僅存在一個(gè)功能性的單分型NLS。

最近的研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核除了需要自身攜帶的NLS外，還需要通過核轉(zhuǎn)運(yùn)受體importin α和/或importin β兩個(gè)輸入蛋白家族成員識(shí)別和結(jié)合其NLS，將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核[24-25]。例如胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5(insulin-like growth factor-binding protein 5, IGFBP-5)進(jìn)入細(xì)胞核需要通過importin α5結(jié)合IGFBP-5蛋白NLS，然后與importin β1形成三元復(fù)合物后進(jìn)入細(xì)胞核，此過程需要importin α5和importin β1的共同作用[26]；Rowe等[27]證實(shí)狂犬病毒(rabies virus，RV)P蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn)僅需要importin β1識(shí)別P蛋白NLS來介導(dǎo)其入核轉(zhuǎn)運(yùn)過程，而不需要importin α家族成員的參與；Pumroy等[28]的研究發(fā)現(xiàn)A型流感病毒PB2蛋白入核轉(zhuǎn)運(yùn)需要importin α3和importin α7的協(xié)同作用，該過程不需要importin β1蛋白的參與。鑒于MATR3蛋白在細(xì)胞生活史中的重要作用，了解其入核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制對(duì)深入研究MATR3蛋白細(xì)胞核定位的功能具有重要意義。本研究成功鑒定了雞MATR3蛋白NLS，這為后續(xù)研究雞MATR3蛋白細(xì)胞核定位的分子機(jī)制奠定了工作基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

雞MATR3蛋白中存在一個(gè)保守的單分型NLS(596PSDKKSK602)介導(dǎo)其細(xì)胞核定位，并且NLS鄰近堿性氨基酸位點(diǎn)不參與MATR3蛋白的細(xì)胞核定位。