王建棟,吳 越,陶 陽,韓永斌,*,周劍忠,葉曉松,葉淑嫻,鄔 超,葉明儒
(1.南京農業(yè)大學 農業(yè)部農畜產品加工與質量控制重點開放實驗室,江蘇 南京 210095;
2.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所,江蘇 南京 210014;3.鎮(zhèn)江市智海食品有限公司,江蘇 鎮(zhèn)江 212000)
藍莓果渣主要是在藍莓果汁和果酒加工過程中產生的,目前這些果渣除了少量用作飼料和肥料外,大多數作為廢物而廢棄,造成極大的浪費和環(huán)境污染,亟待尋找有效的利用途徑。藍莓果渣中富含的花色苷,作為自然界中一類具有類黃酮結構的天然水溶性色素,具有抗動脈硬化[1]、抗衰老[2]和改善光誘導的視網膜病變[3]等功能。因此,選擇一種恰當的花色苷提取分離方式具有重要意義。
生物吸附富集法利用某些細菌、真菌、藻類和生物質等生物吸附劑對水溶液中重金屬離子、染料或酚類物質等進行吸附和富集,以達到某些目的[4-6]。它作為一種高效、綠色、經濟的新興方法,具有很大的研究價值。目前,從藍莓渣中提取花色苷的方法主要有溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、酶解輔助提取法等,但這些非生物吸附富集方法均存在提取效率低、能耗大、溶劑殘留量大等缺點[7];因此生物吸附劑在花色苷分離純化方面的應用成為研究熱點[8-11]。廢啤酒酵母生物吸附劑是啤酒生產過程中的副產物,因其具有成本低廉和吸附特異性強等優(yōu)點而在生物吸附領域具有廣闊的應用前景。目前,廢啤酒酵母較多地用于金屬離子[12-13]和染料[14-15]吸附,但吸附富集花色苷的報道較少。Stafussa等[11]研究發(fā)現,在溫度25 ℃、轉速140 r/min和吸附時間2 h條件下,廢啤酒酵母對葡萄渣提取物中花色苷的吸附量為1.335 mg/g,該結果表明廢啤酒酵母對花色苷具有很好的吸附效果。
近年來,超聲波技術被應用到生物吸附研究中,超聲輔助吸附主要是利用超聲波產生強烈的空化效應增強液相質點的運動,強化固-液兩相的傳質過程,從而提高吸附速率和吸附量[16-17]。Gupta等[16]利用改性西瓜皮吸附污水中的銅離子,發(fā)現振蕩條件下達到吸附平衡時間為60 min,而90 W超聲條件下僅為20 min,吸附速率顯著提高;Djelloul等[17]采用水飛薊籽粉吸附水溶液中的亞甲基藍染料,結果表明,30 W和60 W超聲條件下的吸附量分別比常規(guī)吸附高27.07%和82.17%。
關于描述吸附劑或生物吸附劑分離純化花色苷過程的動力學模型主要有Lagergren一級動力學模型、二級動力學模型和粒子內擴散模型[11,18],等溫吸附模型主要有Langmuir、Freundlich、Temkin和Dubinine-Radushkevich等[11,19]。Stafussa等[11]利用廢啤酒酵母對葡萄渣提取物中的花色苷進行吸附,并研究了其吸附過程中的動力學和熱力學特性,結果表明Lagergren二級動力學模型和Temkin等溫吸附模型對其吸附過程具有更好的模擬效果。
因此,本研究選擇啤酒廠的廢啤酒酵母作為吸附劑,首先對靜置、水浴振蕩與超聲波輔助廢啤酒酵母吸附藍莓渣中花色苷的效果進行了比較,然后考察了吸附時間、超聲強度、吸附溫度和藍莓渣提取液中花色苷初始質量濃度對廢啤酒酵母吸附藍莓渣中花色苷的影響,在此基礎上對吸附前后單體花色苷組分變化、吸附動力學、等溫吸附模型和吸附機制進行了初步分析,旨在為超聲波輔助廢啤酒酵母吸附分離藍莓渣中花色苷的工藝提供理論依據。
藍莓(品種‘Garden blue’),由江蘇省南京市溧水藍莓種植基地提供,2016年7月采摘、洗凈和榨汁后得到的果渣于-18 ℃貯藏備用;廢啤酒酵母泥由青島啤酒股份有限公司科研開發(fā)中心提供,于-18 ℃貯藏備用。
三氟乙酸和乙腈(色譜純) 國藥集團化學試劑有限公司;溴化鉀(光譜純) 上海源葉生物科技有限公司;飛燕草色素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、芍藥色素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-阿拉伯苷(標準品)美國Sigma公司;其他試劑均為分析純。
LSHZ-300冷凍水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠;CKDC-1006程序控溫低溫恒溫浴槽 南京凡帝朗信息科技有限公司;VCX130超聲波細胞破碎儀美國Sonics公司;IR100傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)儀 美國Nicolet公司;1200高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 美國安捷倫公司。
1.3.1 廢啤酒酵母凍干粉制備
參照Stafussa等[11]的方法并稍加修改。用蒸餾水將廢啤酒酵母泥清洗3 遍后冷凍干燥,粉碎過100 目篩,得到的廢啤酒酵母封裝于鋁箔袋內,置于干燥器中備用。
1.3.2 藍莓渣花色苷的提取
參照Cui Chun等[20]的方法并稍加修改。藍莓渣常溫下避光解凍后,稱取100 g藍莓渣,以料液比1∶15(m/V)浸漬于pH 2、體積分數為50%的鹽酸-乙醇溶液中,室溫下浸提12 h后,5 000 r/min離心15 min,收集上清液,于-18 ℃貯藏備用。
1.3.3 靜置、水浴振蕩與超聲波輔助廢啤酒酵母吸附藍莓渣提取液中花色苷
靜置吸附:準確稱取300 mg廢啤酒酵母凍干粉于100 mL錐形瓶中,加入50 mL花色苷質量濃度為180 mg/L的藍莓渣提取液(pH 2.0),在40 ℃條件下放置120 min。分別在0、5、10、20、30、45、60、90 min和120 min時吸取樣液500 μL,10 000 r/min離心5 min,收集上清液測定總花色苷含量,并計算其吸附量。
水浴振蕩輔助吸附:準確稱取300 mg廢啤酒酵母凍干粉于100 mL錐形瓶中,加入50 mL花色苷質量濃度為180 mg/L的藍莓渣提取液(pH 2.0),在40 ℃、160 r/min條件下處理120 min,后續(xù)處理同靜置吸附。
超聲波輔助吸附:準確稱取300 mg廢啤酒酵母凍干粉于100 mL錐形瓶中,加入50 mL花色苷質量濃度為60~240 mg/L的藍莓渣提取液(pH 2.0),在20~40 ℃溫度和超聲強度199~394 W/L條件下處理120 min,后續(xù)處理同靜置吸附。
1.3.4 吸附模型
1.3.4.1 動力吸附模型
準確稱取300 mg廢啤酒酵母凍干粉于100 mL錐形瓶中,加入50 mL花色苷質量濃度為180 mg/L的藍莓渣提取液,在394 W/L超聲強度和20、30、40 ℃不同溫度梯度下進行超聲波輔助吸附120 min。分別在0、5、10、20、30、45、60、90 min和120 min時吸取樣液500 μL,10 000 r/min離心5 min,收集上清液測定總花色苷含量,并計算其吸附量。本研究采用Lagergren一級動力學方程(式(1))和二級動力學方程(式(2))[11,18]對不同溫度下的吸附數據進行擬合。
式中:qt為t時刻的花色苷吸附量/(mg/g);qe為平衡時的花色苷吸附量/(mg/g);t為吸附時間/min;k1為一級動力學速率常數/min-1;k2為二級動力學速率常數/(g/(mg·min))。
1.3.4.2 等溫吸附模型
準確稱取300 mg廢啤酒酵母凍干粉于100 mL錐形瓶中,加入50 mL花色苷質量濃度為60~180 mg/L的藍莓渣提取液,在超聲強度為394 W/L、溫度為40 ℃條件下進行超聲波輔助吸附120 min。在120 min時吸取樣液500 μL,10 000 r/min離心5 min,收集上清液測定總花色苷含量,并計算其吸附量。為了描述花色苷吸附過程中吸附平衡關系,本研究采用Freundlich等溫吸附方程(式(3))和Temkin等溫吸附方程(式(4))對得到的實驗數據進行擬合[11,19]。
式中:KF/(L/g)、n為經驗常數;ρe為平衡質量濃度/(mg/L);A為最大吸附量的平衡常數/(L/mg);bT為Temkin等溫吸附常數/(kJ/mol);T為絕對溫度/K;R為理想氣體常數(8.314 J/(K·mol))。
1.3.5 分析與測試方法
1.3.5.1 花色苷含量和吸附量的測定
總花色苷含量用分光光度法測定[21]。將乙醇、水、鹽酸三者按體積比69∶30∶1混合,配制成溶液,樣品用此溶液稀釋,于520 nm波長處測定吸光度(A520nm)??偦ㄉ召|量濃度以每升藍莓渣提取液中含有的錦葵色素-3-葡萄糖苷質量計。按公式(5)計算。
式中:d表示樣品的稀釋倍數。
花色苷吸附量計算見公式(6)[19]。
式中:qt為t時刻廢啤酒酵母對花色苷的吸附量/(mg/g);ρ0為藍莓渣花色苷提取液的初始質量濃度(mg/L);ρt為花色苷提取液t時刻的質量濃度/(mg/L);V為溶液總體積/mL;m為廢啤酒酵母質量/mg。
1.3.5.2 吸附前后花色苷組分分析
參考Cui Chun等[20]的高效液相色譜法,并稍作修改。對吸附前的藍莓渣花色苷提取液和在超聲強度為394 W/L、溫度為40 ℃條件下吸附后的藍莓渣花色苷提取液進行HPLC分析,色譜柱為TC-C18。
1.3.5.3 吸附前后廢啤酒酵母FTIR變化
參照Stafussa等[11]方法進行FTIR測定。將未吸附藍莓渣花色苷的廢啤酒酵母和在超聲強度394 W/L、溫度40 ℃條件下吸附藍莓渣花色苷后的廢啤酒酵母冷凍干燥,按照1∶100(m/m)的比例加入光譜純溴化鉀,充分研磨混合后,用壓片機壓成透明薄片,利用FTIR儀(400~4 000 cm-1波數范圍內)分析吸附前后廢啤酒酵母表面化學官能團的變化。
實驗均重復均3 次,結果以平均值±標準差的形式表示,采用Excel 2007軟件對數據進行擬合,采用SPSS 20.0最小顯著性差異法(least-significant difference,LSD)進行差異顯著性檢驗,P<0.05表示差異顯著。
圖1 不同方式下廢啤酒酵母對藍莓渣中的花色苷吸附量Fig.1 Adsorption amounts of anthocyanins by waste beer yeast in different modes
由圖1可知,靜置、水浴振蕩與超聲波輔助廢啤酒酵母吸附花色苷量均隨吸附時間的延長呈現上升趨勢,并且在前20 min內吸附速率較快,分別完成了吸附總量的60.64%、62.89%和70.11%。此后,吸附速率逐漸降低,直至120 min達到吸附平衡,隨后花色苷吸附量增幅較為平緩。這可能是在吸附反應初期,啤酒酵母表面有大量活性吸附位點,溶液中的花色苷能夠迅速與活性位點結合,因此吸附反應很容易進行;隨著反應的繼續(xù),活性位點逐漸被占據,吸附開始變得緩慢,直至最后達到平衡[22]。
從圖1還可看出,在20 min時,超聲強度394 W/L下花色苷吸附效率達到70.11%,顯著高于靜置(60.64%)和水浴振蕩條件下的吸附效率(62.89%)(P<0.05)。此后,超聲條件下花色苷吸附效率和吸附量始終最高。在120 min達到吸附平衡時,超聲條件下花色苷吸附量為9.69 mg/g,顯著高于靜置吸附的2.26 mg/g和振蕩輔助吸附的7.03 mg/g(P<0.05)。因此,超聲波輔助廢啤酒酵母吸附花色苷的效果明顯優(yōu)于靜置和振蕩條件下的吸附效果。
由圖2可知,在不同超聲強度下,隨著吸附時間的延長,廢啤酒酵母對花色苷的吸附量均呈現上升的趨勢,并且在前20 min內吸附速率較快,之后吸附變得緩慢,吸附速率顯著降低(P<0.05),120 min時基本達到吸附平衡。吸附時間相同時,超聲強度越強,吸附速率越大,吸附量越高,總體表現為不同超聲強度對于花色苷吸附有顯著性影響(P<0.05),199、279 W/L和394 W/L條件下的花色苷平衡吸附量分別為7.42、8.91、9.69 mg/g。這可能是超聲產生強烈的空化效應,加快傳質和傳熱速度,從而促進花色苷與啤酒酵母活性位點的結合,同時超聲波產生的振蕩作用加速了花色苷分子的擴散,可以極大地提高吸附效率和吸附量[16]。當然超聲強度過高時,因超聲空化作用產生的高溫高壓不僅會使酵母細胞壁破裂,同時花色苷也會發(fā)生降解,致使廢啤酒酵母對花色苷的吸附能力下降[7,23]。
由圖3可知,不同溫度條件下,隨著吸附時間的延長,廢啤酒酵母對花色苷的吸附量均呈現上升趨勢,且在前20 min內吸附速率較快,之后吸附速率逐漸降低,在120 min基本達到吸附平衡。在相同的時間間隔內,隨著溫度的升高,廢啤酒酵母菌對花色苷的吸附量增加,但是變化并不顯著(P>0.05),20、30 ℃和40 ℃條件下的花色苷平衡吸附量分別為9.15、9.37 mg/g和9.69 mg/g。這可能是在較高的溫度條件下,酵母表面一些吸附位點被活化,并且花色苷分子運動速率加快,與酵母表面接觸機會增多,從而促進花色苷與啤酒酵母活性位點的結合,使得吸附量變大[22]。從實際生產的耗能和經濟方面考慮,廢啤酒酵母菌對藍莓渣花色苷的生物吸附在常溫下進行更為合理。
由圖4可知,廢啤酒酵母菌對花色苷的平衡吸附量隨著花色苷初始質量濃度的增大而增加。這可能是當初始花色苷質量濃度增大時,花色苷與酵母吸附劑之間的有效碰撞概率增大,從而使得平衡吸附量增加[17]。當花色苷初始質量濃度大于180 mg/L時,廢啤酒酵母對花色苷的平衡吸附量增加緩慢,其吸附容量接近飽和,即廢啤酒酵母對花色苷的最大吸附量達到9.69 mg/g左右。一方面可能是因為較高的花色苷質量濃度容易增加固-液之間的傳質阻力,導致花色苷分子向啤酒酵母表面遷移的動力下降[22];另一方面,廢啤酒酵母表面的吸附位點基本上與花色苷結合完全,幾乎達到飽和狀態(tài),從而導致較高花色苷質量濃度條件下的平衡吸附量幾乎不發(fā)生變化[24]。綜合考慮吸附效率和吸附量,選取花色苷初始質量濃度為180 mg/L較為合適。
圖4 藍莓渣花色苷初始質量濃度對超聲輔助廢啤酒酵母吸附的影響Fig.4 Effect of initial anthocyanin concentration on biosorption of anthocyanins by waste beer yeast
對溫度20、30 ℃和40 ℃和超聲強度394 W/L條件下得到的廢啤酒酵母菌對花色苷的吸附動力學數據進行擬合,結果如表1所示。在不同溫度下模擬得到的二級動力學方程比一級動力學方程能夠更好地擬合實驗結果,二級動力學方程的擬合結果的相關系數r均大于0.999,而一級動力學方程的相關系數r僅為0.97左右。另外,根據二級動力學方程計算得到的平衡吸附量qe比一級動力學方程計算出的平衡吸附量更接近實驗得到的平衡吸附量(圖3),并且隨著溫度的升高,其吸附速率常數k1和平衡吸附量理論值qe也增大,與之前不同溫度梯度下的吸附實驗結果相一致(圖3)。這表明二級動力學模型能夠很好地模擬廢啤酒酵母對花色苷的吸附過程,也說明廢啤酒酵母對花色苷的吸附是一個化學作用的過程[18]。Stafussa等[11]對廢啤酒酵母對葡萄渣花色苷吸附數據進行動力學分析,證明二級動力學模型擬合效果最佳,相關系數r為0.989,qe為1.347 mg/g。Buran等[25]利用FPX66、XAD4和XAD7HP 3 種大孔樹脂對藍莓花色苷進行吸附特性研究,發(fā)現二級動力學模型比一級動力學模型擬合效果更好,相關系數r均大于0.99。
表1 一級和二級動力學模型基本參數及相關系數Table1 Kinetic parameters of pseudo-first order and pseudo-second order models
為了描述超聲波輔助啤酒酵母吸附花色苷過程中的吸附平衡關系,本研究選擇Freundlich等溫吸附方程和Temkin等溫吸附方程對花色苷吸附過程進行分析。Freundlich等溫吸附模型為經驗模型,它假設吸附劑表面的吸附位點并非均勻分布,同時是在各種非理想條件下發(fā)生的多分子層吸附;Temkin等溫吸附模型是一種單分子層吸附模型,它假定固體吸附劑表面是不均勻的,同時吸附過程的吸附自由能是其表面覆蓋的作用,微分吸附熱隨表面覆蓋度線性下降[11,19]。
表2 Freundlich和Temkin等溫吸附模型擬合基本參數及相關系數Table2 Parameters of Langmuir and Temkin isotherm models for biosorption of anthocyanins by waste beer yeast
由表2可知,采用Temkin等溫吸附模型對花色苷吸附實驗數據擬合時,線性相關性較好,相關系數r達到0.995 3,這表明Temkin等溫吸附模型能較好地描述廢啤酒酵母菌對藍莓渣花色苷的吸附行為。Stafussa等[11]采用4 種等溫吸附模型對廢啤酒酵母菌吸附葡萄渣花色苷過程進行分析,結果發(fā)現,Temkin等溫吸附模型擬合效果最好,相關系數r達到0.996 0,其他3 種模型擬合效果則較差。
實驗數據用Freundlich等溫吸附模型擬合時,也表現出了較好的線性關系,相關系數為0.978 1。本研究計算得到n=1.030 5,根據以前研究[11,26],當1<n<10時,表明吸附容易進行,且廢啤酒酵母菌對藍莓渣花色苷的吸附為優(yōu)惠吸附;當1<1/n<2時,表明固體吸附劑的表面是不均勻的,即此吸附是在表面不均勻的體系下發(fā)生的。
參考Li Chunyang等[27]的研究結果,并結合前期HPLC-質譜(mass spectrometer,MS)結構鑒定結果可知,藍莓渣中所含的主要單體花色苷為飛燕草色素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、芍藥色素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷和錦葵色素-3-阿拉伯苷(圖5A)。
采用HPLC分析吸附前后藍莓渣中的單體花色苷成分,結果表明,廢啤酒酵母對各種單體花色苷進行了不同程度的吸附,其中,對錦葵色素-3-葡萄糖苷的吸附率最高(31.48%),對芍藥色素-3-葡萄糖苷的吸附率最低(20.97%)(表3),這與Mazzaracchio等[28]的研究結果相似。廢啤酒酵母對各種花色苷吸附程度的差異可能與其化學結構相關,B環(huán)上羥基數量的增加和糖苷基團的減少可能會使花色苷吸附量升高。
圖5 吸附前(A)和吸附后(B)藍莓渣中花色苷HPLC圖Fig.5 HPLC chromatograms of blueberry pomace anthocyanins before (A) and after (B) biosorption
表3 吸附前后藍莓渣中主要單體花色苷含量的變化Table3 Changes in anthocyanin composition of blueberry pomace before and after biosorption
對吸附花色苷前后的廢啤酒酵母官能團變化進行FTIR測定,采用OMNIC 8.0軟件進行分析,結果如圖6所示。通過查閱文獻[11,16,18]可知,吸附前的廢啤酒酵母主要在以下幾處有吸收峰(圖6A):3 289.86(—OH或—NH2)、2 925.43(—CH2)、1 638.31(酰胺基團Ⅰ帶)、1 584.22(酰胺基團Ⅱ帶)、1 453.92(C—OH)、1 245.46 cm-1(酰胺基團Ⅲ帶)和1 042.13 cm-1(C—O—C或C—O)。在廢啤酒酵母吸附花色苷后(圖6B),3 289.86 cm-1處吸收峰移動到3 287.71 cm-1,可能是基于—OH或—NH2的伸縮振動作用;吸附后1 638.31 cm-1和1 245.41 cm-1處的吸收峰分別移動到1 627.94 cm-1和1 234.58 cm-1,1 584.22 cm-1處的吸收峰在吸附后消失,表明啤酒酵母表面的酰胺基團參與了花色苷的吸附作用;吸附后1 453.92 cm-1和1 042.13 cm-1處的吸收峰分別移動到1 451.00 cm-1和1 044.63 cm-1,表明啤酒酵母多糖所含的某些官能團在吸附過程中起到一定的作用。據報道,多酚類物質中的大量酚羥基與蛋白質主鏈的酰胺基(—C O N H),側鏈上的羥基(—O H)、氨基(—NH2)以及羧基(—COOH)以氫鍵的形式多點結合,并且啤酒酵母細胞壁富含多聚糖,多聚糖中的大量羥基也可通過氫鍵的作用吸附花色苷[29-30]。由此可知,蛋白質和多糖物質中的氨基、羥基和酰胺基團在廢啤酒酵母吸附花色苷的過程中起著關鍵作用。
圖6 吸附前(A)和吸附后(B)廢啤酒酵母傅里葉變換紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of waste beer yeast before (A) and after (B) biosorption
超聲強度394 W/L下花色苷吸附量顯著高于靜置吸附量和振蕩輔助吸附量(P<0.05);隨著吸附時間的延長,廢啤酒酵母對花色苷的吸附量增加,在120 min時基本達到吸附平衡;隨著超聲強度的增加和溫度的升高,廢啤酒酵母對花色苷的吸附量增加;在一定花色苷初始質量濃度范圍內(60~180 mg/L),廢啤酒酵母菌對花色苷的平衡吸附量隨著花色苷初始質量濃度的增加而增加,當大于180 mg/L時,其平衡吸附量增加緩慢。
在溫度30、40 ℃和50 ℃和超聲強度394 W/L條件下的吸附動力學行為表明,廢啤酒酵母對藍莓渣中花色苷的吸附過程較好地符合二級動力學模型(相關系數r>0.999),3 個溫度條件下花色苷平衡吸附量分別為9.15、9.37 mg/g和9.69 mg/g。
在溫度40 ℃和超聲強度394 W/L條件下的等溫吸附研究表明,廢啤酒酵母對藍莓渣中花色苷的吸附過程可以用Freundlich和Temkin等溫吸附模型擬合,但是Temkin方程的模擬效果更好(相關系數r>0.99)。
對吸附前后藍莓渣中的花色苷成分進行HPLC分析可知,廢啤酒酵母對各種單體花色苷進行了不同程度的吸附,錦葵色素-3-葡萄糖苷吸附率最高,芍藥色素-3-葡萄糖苷吸附率最低;FTIR分析得知廢啤酒酵母表面的氨基、羥基和酰胺基團在廢啤酒酵母吸附花色苷的過程中起著關鍵作用。這些均表明廢啤酒酵母對花色苷具有良好的吸附效果。
綜上所述,廢啤酒酵母對吸附藍莓渣中花色苷而言是一種高效廉價的生物吸附劑,它在分離富集花色苷方面具有廣闊的應用前景。