趙謀明，李巧琳，林戀竹*，楊延清

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

辣木（Moringa oleifera Lam.），原產(chǎn)于印度，是辣木科辣木屬多年生熱帶落葉喬木，廣泛種植于亞洲和非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)廣東、廣西、云南、福建、臺(tái)灣等地引種栽培[1]。辣木作為一種新資源食品，具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快速、營(yíng)養(yǎng)豐富全面、生物活性多等優(yōu)點(diǎn)[2-3]，在印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用歷史悠久，具有潛在的開(kāi)發(fā)前景[4]。研究表明，辣木葉含有豐富的蛋白質(zhì)（干葉粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.0%～30.3%）[1-2]，辣木葉中氨基酸種類豐富，共有19 種，以谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸含量較高[5]。同時(shí)，辣木葉富含多種礦物質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸、糖苷及多酚類化合物、甾醇、生物堿等小分子活性物質(zhì)[6-8]。辣木葉具有抗氧化[9]、抗菌[10]、抗病毒[11]、抗炎[12]、降血糖[13]、降血脂[14]、降血壓[15-17]、抗腫瘤[18-19]、保護(hù)肝臟[20-21]、改善腎功能障礙[22]、抑制DNA氧化損傷[23]、調(diào)節(jié)腸道微生物[24]、抗?jié)僛25]等多種生物活性。

在辣木資源的利用上，早期多集中在辣木傳統(tǒng)的食用藥用、飲水凈化和作為植物蛋白飼料等方面，近年來(lái)開(kāi)始注重辣木功能性成分的提取和保健食品的開(kāi)發(fā)。然而，在辣木葉保健食品開(kāi)發(fā)方面，目前國(guó)內(nèi)仍處于以辣木葉粉、辣木葉汁、辣木葉蛋白為原料的簡(jiǎn)單產(chǎn)品添加階段[1]，缺乏對(duì)辣木葉精深加工技術(shù)的研究，限制了其高值化加工應(yīng)用及市場(chǎng)推廣。

本研究考察不同提取方法對(duì)辣木葉蛋白、糖類、多酚類物質(zhì)提取率以及抗氧化劑溶出率的影響，以期獲得蛋白、糖類、多酚含量高且抗氧化活性強(qiáng)的辣木葉提取物，為辣木葉高值化加工提供理論與方法的支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木干葉 廣東華谷辣木生物科技有限公司；Ns37071蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、復(fù)合蛋白酶 諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、水溶性VE（Trolox）、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）、熒光素鈉、氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitroblue tetrazolium，NBT）、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶 美國(guó)Sigma公司；乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、二甲基亞砜、濃硫酸（均為分析純） 富宇化學(xué)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；UH-150A型超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；THZ-82A型恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KND-2C型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；HSG-IIB-6型電熱恒溫水浴鍋 上海儀表集團(tuán)；UV-754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Varioskan Flash型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木葉提取物的制備

辣木干葉于60 ℃烘箱中烘2 h至恒質(zhì)量，粉碎，得辣木干葉粉。按以下方法進(jìn)行提取，所得提取液濃縮后定容至100 mL，4 ℃保存。

1.3.1.1 水/乙醇提取

高溫水提?。悍Q取辣木干葉粉（20 g），按料液比1∶10（m/V）加入去離子水，105 ℃高溫下處理2 h，離心取上清液，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄌ崛? 次，合并上清液。

超聲輔助水提?。悍Q取辣木干葉粉（20 g），按料液比1∶10（m/V）加入去離子水，55 ℃、800 W超聲提取40 min，離心取上清液，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄌ崛? 次，合并上清液。

超聲輔助乙醇提取：稱取辣木干葉粉（20 g），按料液比1∶10（m/V）加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液，55 ℃、800 W超聲提取40 min，離心取上清液，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄌ崛? 次，合并上清液。

中溫水提?。悍Q取辣木干葉粉（20 g），按料液比1∶10（m/V）加入去離子水，55 ℃提取3 h，離心取上清液，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄌ崛? 次，合并上清液。

1.3.1.2 酶法提取

稱取辣木干葉粉（20 g），按料液比1∶10（m/V）加入去離子水，調(diào)節(jié)pH值，55 ℃孵育30 min。按3 000 U/g蛋白分別加入Ns37071蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、復(fù)合蛋白酶，55 ℃酶解8 h，95 ℃、15 min高溫滅酶，離心取上清液。

1.3.1.3 酶法耦合乙醇提取

稱取辣木干葉粉（20 g），按料液比1∶10（m/V）加入去離子水，調(diào)節(jié)pH值，55 ℃孵育30 min。按3 000 U/g蛋白分別加入Ns37071蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、復(fù)合蛋白酶，55 ℃酶解8 h，加入乙醇調(diào)節(jié)至乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，回流提取30 min，離心取上清液。

1.3.1.4 酶解提取后殘?jiān)曒o助乙醇提取

取1.3.1.2節(jié)酶法提取后余下的辣木葉渣，按料液比1∶10（m/V）加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液，55 ℃、800 W超聲提取40 min，離心取上清液。

1.3.2 辣木葉提取物的分級(jí)萃取

取1.3.1節(jié)所得辣木干葉提取物5 mL，等體積加入乙酸乙酯，萃取3 次，合并乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以二甲基亞砜定容至1 mL，得乙酸乙酯相，剩余部分用蒸餾水定容至5 mL，得水相。

1.3.3 蛋白、總糖、總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

1.3.3.1 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

參考GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，采用凱氏定氮法測(cè)定，計(jì)算各提取方法的蛋白提取率（式（1））。

1.3.3.2 總糖含量測(cè)定

參考GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測(cè)定》，采用苯酚-硫酸法測(cè)定。取適合質(zhì)量濃度樣品1 mL，加1 mL去離子水搖勻，加入1 mL 6 g/100 mL苯酚，馬上加入5 mL濃硫酸，搖勻，室溫反應(yīng)40 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的葡萄糖溶液，按以上步驟測(cè)定其490 nm波長(zhǎng)處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品總糖含量以葡萄糖質(zhì)量表示，計(jì)算各提取方法的糖類物質(zhì)提取率（式（2））。

1.3.3.3 總酚含量測(cè)定

采用福林-酚法[26]測(cè)定總酚。取適合質(zhì)量濃度樣品1 mL，加5 mL去離子水搖勻，加入0.5 mL福林-酚、在1～8 min內(nèi)加入1.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的Na2CO3溶液，加2 mL去離子水定容至10 mL，搖勻，40 ℃孵育2 h，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL的沒(méi)食子酸溶液，按以上步驟測(cè)定其760 nm波長(zhǎng)處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品總酚含量以沒(méi)食子酸質(zhì)量表示，計(jì)算各提取方法的多酚類物質(zhì)提取率（式（3））。

1.3.4 體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力

取適合質(zhì)量濃度樣品2 mL，加2mL DPPH無(wú)水乙醇溶液（0.2 mmol/L），搖勻，室溫下暗處?kù)o置30 min，以無(wú)水乙醇調(diào)零，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。用無(wú)水乙醇配制濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L的Trolox溶液，按以上步驟測(cè)定其517 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算DPPH自由基清除率。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，DPPH清除率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品DPPH自由基清除能力以Trolox當(dāng)量表示，計(jì)算各提取方法的DPPH自由基清除劑溶出率（式（4））。

1.3.4.2 氧化自由基吸收能力

以75 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液配制所需濃度的樣品、Trolox、熒光素鈉以及AAPH。于96 孔板中依次加入適合質(zhì)量濃度樣品20 μL、120 μL熒光素鈉（70 nmol/L），于酶標(biāo)儀中混勻，37 ℃孵育15 min，迅速加入60 μL AAPH（40 mmol/L），于酶標(biāo)儀中混勻并開(kāi)始測(cè)定熒光強(qiáng)度（f0）。熒光強(qiáng)度為激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、吸收波長(zhǎng)520 nm，每1 min測(cè)定1 次，共讀數(shù)121 次。熒光強(qiáng)度分別記為f0、f1、f2……、f120，將每次讀數(shù)連成曲線，每個(gè)樣品3 個(gè)復(fù)孔。磷酸鹽緩沖液為試劑空白。根據(jù)公式（5）計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）（熒光猝滅面積）。

配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L的Trolox溶液，按以上步驟測(cè)定樣品AUC（AUC樣品）和空白AUC（AUC空白），計(jì)算其相應(yīng)Net AUC（式（6））。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，Net AUC為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品氧化自由基吸收能力以Trolox當(dāng)量表示，計(jì)算各提取方法的氧化自由基吸收劑溶出率（式（7））。

1.3.4.3 超氧陰離子自由基清除能力

以0.2 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液配制所需劑量的樣品、Trolox、NBT、黃嘌呤以及黃嘌呤氧化酶。于96 孔板中依次加入50 μL適合質(zhì)量濃度樣品、50 μL黃嘌呤（1 mmol/L）、60 μL NBT（2 mmol/L）、50 μL黃嘌呤氧化酶（0.05 U/mL），于酶標(biāo)儀中混勻，37 ℃孵育30 min，于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。配制濃度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 mmol/L的Trolox溶液，以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，超氧陰離子自由基清除率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品超氧陰離子自由基清除能力以Trolox當(dāng)量表示，計(jì)算各提取方法的超氧陰離子清除劑溶出率（式（8））。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方式對(duì)辣木葉蛋白提取率的影響

經(jīng)測(cè)定，辣木干葉粉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（33.11±0.36）%。不同提取方式對(duì)辣木葉蛋白提取率的影響如表1所示。采用超聲輔助乙醇提取法所制得的辣木葉提取物中蛋白提取率較低（20.37%）；采用水提法時(shí)，辣木葉蛋白提取率有所提高（29.32%～36.17%）；采用酶法和酶法耦合乙醇提取可顯著提高辣木葉蛋白提取率，其中以Ns37071蛋白酶、胰酶提取所制得的辣木葉提取物蛋白提取率最高。采用超聲輔助乙醇提取酶解提取后殘?jiān)锰崛∥镏械鞍滋崛÷首畹停?.66%～4.55%），說(shuō)明采用酶法可高效提取辣木葉蛋白。采用乙酸乙酯萃取辣木葉提取物，所得水相蛋白提取率與總提取物無(wú)顯著性差異，表明蛋白（水解蛋白）均在水相中，而乙酸乙酯相不含蛋白（水解蛋白）。

表1 不同提取方式對(duì)辣木葉蛋白提取率的影響Table1 Effects of different extraction methods on the yield of proteins

2.2 不同提取方式對(duì)辣木葉糖類物質(zhì)提取率的影響

表2 不同提取方式對(duì)辣木葉糖類物質(zhì)提取率的影響Table2 Effects of different extraction methods on the yield of saccharides

不同提取方式對(duì)辣木葉糖類物質(zhì)提取率的影響如表2所示。采用水提法和酶法所制得的辣木葉提取物中糖類物質(zhì)的提取率最高，采用乙醇提取時(shí)，糖類物質(zhì)提取率較低。糖類物質(zhì)的水溶性好，因此采用水提法可獲得含糖量高的辣木葉提取物。采用超聲輔助乙醇提取酶解提取后殘?jiān)?，所得提取物中糖類物質(zhì)提取率最低，說(shuō)明采用水提法可高效提取辣木葉糖類物質(zhì)。采用乙酸乙酯萃取辣木葉提取物，所得水相糖類物質(zhì)提取率與總提取物無(wú)顯著性差異，表明糖類物質(zhì)均在水相中，而乙酸乙酯相不含糖類物質(zhì)。

2.3 不同提取方式對(duì)辣木葉多酚類物質(zhì)提取率的影響

表3 不同提取方式對(duì)辣木葉多酚類物質(zhì)提取率的影響Table3 Effects of different extraction methods on the yield of phenolics

不同提取方式對(duì)辣木葉多酚類物質(zhì)提取率的影響如表3所示。本研究中采用福林-酚法測(cè)定提取物中多酚含量。福林-酚法是基于電子轉(zhuǎn)移機(jī)制的一種測(cè)定方法，具有還原能力的多酚類物質(zhì)、蛋白（水解蛋白）、糖類物質(zhì)均可與福林-酚試劑反應(yīng)。辣木葉提取物中蛋白、糖類物質(zhì)含量豐富，采用該方法測(cè)定總提取物中多酚含量時(shí)，會(huì)使得結(jié)果偏高。結(jié)果表明：水相多酚類物質(zhì)提取率較高，而乙酸乙酯相多酚提取率相對(duì)較低。而根據(jù)2.1節(jié)和2.2節(jié)的研究結(jié)果，蛋白（水解蛋白）以及糖類物質(zhì)不存在于乙酸乙酯相中，因此，乙酸乙酯相中的物質(zhì)應(yīng)為以多酚類物質(zhì)為主的小分子活性物質(zhì)。水相中的物質(zhì)主要是蛋白（水解蛋白）以及糖類物質(zhì)。

采用水提法時(shí)，提取物中多酚提取率為17.85～19.27 mg沒(méi)食子酸/g辣木葉；采用超聲輔助乙醇提取時(shí)，總提取物中多酚提取率較超聲輔助水提取并無(wú)顯著性提高。采用酶法和酶法耦合乙醇提取可顯著提高辣木葉多酚提取率，其中以Ns37071蛋白酶、胰酶所制得的辣木葉提取物多酚提取率最高，這主要是因?yàn)椴捎妹阜ê兔阜詈弦掖继崛】筛咝崛±蹦救~中蛋白（水解蛋白）與糖類物質(zhì)。采用超聲輔助乙醇提取酶解提取后殘?jiān)锰崛∥镏卸喾宇愇镔|(zhì)提取率最低，說(shuō)明采用酶法可高效提取辣木葉多酚類物質(zhì)。此外，采用超聲輔助乙醇提取法以及酶法耦合乙醇提取法可顯著提高乙酸乙酯相中多酚提取率，這與多酚為脂溶性物質(zhì)，易溶于乙醇有關(guān)。綜上所述，采用酶法耦合乙醇提取法，可以制備得到蛋白（水解蛋白）、糖類、多酚類物質(zhì)含量高的辣木葉提取物。

2.4 不同提取方式對(duì)辣木葉中DPPH自由基清除劑溶出率的影響

表4 不同提取方式對(duì)辣木葉中DPPH自由基清除劑溶出率的影響Table4 Effects of different extraction methods on the yield of DPPH radical scavenger

DPPH自由基法是基于電子轉(zhuǎn)移機(jī)制的一種快速評(píng)價(jià)樣品還原能力的方法，所得樣品DPPH自由基清除能力能夠間接反映樣品的抗氧化能力[27]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究結(jié)果證實(shí)了蛋白水解物（多肽）、多糖以及多酚類物質(zhì)的抗氧化活性，使得多肽、多糖、多酚類物質(zhì)成為眾所周知的功能性因子[28-30]。2.1～2.3節(jié)研究結(jié)果表明辣木葉提取物富含蛋白、糖類以及多酚類物質(zhì)。不同提取方式對(duì)辣木葉中DPPH自由基清除劑溶出率的影響如表4所示。采用酶法耦合乙醇提取時(shí)，DPPH自由基清除劑溶出率最高，其中，采用Ns37071蛋白酶和胰酶時(shí)，所得提取物中DPPH自由基清除劑溶出率最高。這是因?yàn)椋翰捎妹阜ㄋ苽涞奶崛∥镏械鞍祝ㄋ獾鞍祝┮约疤穷愇镔|(zhì)含量最高；采用酶法耦合乙醇提取法所制備的提取物中蛋白（水解蛋白）、糖類、多酚類物質(zhì)含量最高。采用乙酸乙酯萃取，將辣木葉提取物分為乙酸乙酯相以及水相，可以看出，水相中DPPH自由基清除劑溶出率遠(yuǎn)高于乙酸乙酯相，說(shuō)明蛋白（水解蛋白）以及糖類物質(zhì)對(duì)辣木葉提取物DPPH自由基清除活性的貢獻(xiàn)大于多酚類物質(zhì)。乙酸乙酯相以及水相中DPPH自由基清除劑溶出率的加和值遠(yuǎn)低于實(shí)測(cè)值（辣木葉總提取物的DPPH自由基清除劑溶出率），說(shuō)明蛋白（水解蛋白）、糖類、多酚類物質(zhì)三者的協(xié)同作用對(duì)于辣木葉DPPH自由基清除活性的發(fā)揮起到至關(guān)重要的作用。

2.5 不同提取方式對(duì)辣木葉中氧化自由基吸收劑溶出率的影響

氧化自由基吸收能力法是基于質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)制的一種普遍使用的抗氧化能力評(píng)價(jià)方法，能夠準(zhǔn)確反映樣品對(duì)氧化自由基的吸收能力[27]。本實(shí)驗(yàn)研究了不同提取方式對(duì)辣木葉中氧化自由基吸收劑溶出率的影響，結(jié)果如表5所示。采用酶法耦合乙醇提取時(shí)，氧化自由基吸收劑溶出率最高，其中，采用Ns37071蛋白酶和胰酶時(shí)，所得提取物中氧化自由基吸收劑溶出率最高。水相中氧化自由基吸收劑溶出率遠(yuǎn)高于乙酸乙酯相，說(shuō)明蛋白（水解蛋白）以及糖類物質(zhì)對(duì)辣木葉提取物氧化自由基吸收活性的貢獻(xiàn)大于多酚類物質(zhì)。乙酸乙酯相以及水相中氧化自由基吸收劑溶出率的加和值低于或高于實(shí)測(cè)值（辣木葉總提取物的氧化自由基吸收劑溶出率），說(shuō)明對(duì)于辣木葉提取物的氧化自由基吸收活性，提取物中蛋白（水解蛋白）、糖類、多酚類物質(zhì)存在協(xié)同增效或拮抗作用。

表5 不同提取方式對(duì)辣木葉中氧化自由基吸收劑溶出率的影響Table5 Effects of different extraction methods on the yield of oxygen radical absorbent

2.6 不同提取方式對(duì)辣木葉中超氧陰離子自由基清除劑溶出率的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了不同提取方式對(duì)辣木葉中超氧陰離子自由基清除劑溶出率的影響，結(jié)果如表6所示。采用水提法以及酶法、酶法耦合乙醇提取時(shí)，辣木葉中超氧陰離子自由基清除劑溶出率較高，尤其是以高溫水提法所制得提取物中超氧陰離子自由基清除劑溶出率最高。水相中超氧陰離子自由基清除劑溶出率遠(yuǎn)高于乙酸乙酯相。說(shuō)明蛋白（水解蛋白）以及糖類物質(zhì)對(duì)辣木葉提取物超氧陰離子自由基清除活性的貢獻(xiàn)大于多酚類物質(zhì)。乙酸乙酯相以及水相中超氧陰離子自由基清除劑溶出率的加和值低于或高于實(shí)測(cè)值（辣木葉總提取物的超氧陰離子自由基清除劑溶出率），說(shuō)明對(duì)于辣木葉提取物的超氧陰離子自由基清除活性，提取物中蛋白（水解蛋白）、糖類、多酚類物質(zhì)存在協(xié)同增效或拮抗作用。

表6 不同提取方式對(duì)辣木葉中超氧陰離子自由基清除劑溶出率的影響Table6 Effects of different extraction methods on the yield of superoxide radical scavenger

3 結(jié) 論

采用酶法和酶法耦合乙醇提取法，可以制備得到蛋白（水解蛋白）、糖類和多酚類物質(zhì)含量高且抗氧化活性強(qiáng)的辣木葉提取物。采用Ns37071蛋白酶、胰酶時(shí)，所得辣木葉提取物蛋白、糖類、多酚類物質(zhì)提取率最高，抗氧化活性最強(qiáng)。

蛋白（水解蛋白）以及糖類物質(zhì)對(duì)辣木葉提取物抗氧化活性的貢獻(xiàn)大于多酚類物質(zhì)，蛋白（水解蛋白）以及糖類物質(zhì)是辣木葉提取物發(fā)揮抗氧化活性重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，辣木葉提取物中蛋白（水解蛋白）、糖類、多酚類物質(zhì)存在協(xié)同增效或拮抗作用。