黃晶晶，余 敏，馬 敏，鄢 嫣，張福生，殷俊峰，謝寧寧,*

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；3.安徽農(nóng)業(yè)大學理學院，安徽 合肥 230036）

鋅是人體必需的微量元素之一。它是機體內(nèi)近2 000 種轉(zhuǎn)錄因子的必需組成部分，與超過300 種代謝酶的活性有關，影響著機體的免疫系統(tǒng)和氧化還原平衡，可以作為慢性血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性病變、免疫紊亂和衰老等病理狀態(tài)下的抗氧化因子和抗炎癥因子[1]。肽金屬螯合物作為一種微量元素補充劑，可以通過肽的吸收途徑轉(zhuǎn)運進入血液循環(huán)系統(tǒng)，吸收效率高、無競爭性，成為當前研究熱點之一。金屬螯合肽（metal chelating peptide，MCP）通常能夠螯合Fe2+[2]、Fe3+[3]、Cu2+[4]、Zn2+[5]和Ca2+[6]等，但現(xiàn)有研究鮮見提及其結(jié)構(gòu)信息與螯合活性之間的關系。Torres-Fuentes等[7]認為MCP和Cu2+的螯合能力與His含量有相關性（R2＝0.68）；de la Hoz等[8]發(fā)現(xiàn)His、Lys和Arg與酵母肽的Fe3+離子的螯合能力有關。目前只初步證明一些特征氨基酸在MCP結(jié)構(gòu)信息中的作用，同時，有關鋅螯合肽結(jié)構(gòu)對螯合活性的影響研究仍顯不足。

基于計算機輔助計算的定量構(gòu)效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）是將化合物的結(jié)構(gòu)信息、理化參數(shù)與生物活性進行分析計算，建立合理的數(shù)學模型，已經(jīng)被成功運用到苦味肽、抗菌肽、抗氧化肽[9]和降壓肽[10]等多種食源性活性肽中，為鋅螯合肽研究提供了切實可行的方法。QSAR基本思路包括：選擇、設計、合成一系列多肽類似物，并測定活性；對多肽類似物序列進行定量表征；統(tǒng)計方法進行建模；分析模型并預測優(yōu)異肽序列。近年來，QSAR的發(fā)展主要是對結(jié)構(gòu)表征中氨基酸描述符和數(shù)學建模中統(tǒng)計方法的研究[11]。氨基酸描述符分為2D描述符和3D描述符，2D描述符主要表征電荷性、疏水性、立體性和氫鍵屬性等參數(shù)。包括了TOF[12]、Z-scale[13]、VHSE[14]、DPPS[15]、T-scale[16]、HESH[17]、VMEE[18]、VSTV[19]、SZOTT[20]、FASGAI[21]、ST-scale[22]、VSTA[19]、SVG[23]、VSW[23]。Sneath等[24]首先進行了肽的QSAR研究，使用了20 種編碼氨基酸的物化屬性作為描述符，通過定量序效模型（quantitative sequence-activity model，QSAM），分析了腦下垂體-抗利尿激素類似物。3D描述符主要表征側(cè)鏈表面積、側(cè)鏈電荷指數(shù)、拓撲參數(shù)和幾何指數(shù)等參數(shù)，包括ISA-ECI[25]、MS-WHIM[26]。建模的分析方法有多元線性回歸、偏最小二乘法（partial least squares method，PLS）、支持向量機、主成分分析、逐逐步線性回歸、人工神經(jīng)網(wǎng)絡和遺傳算法-PLS等[27]。

本研究前期采用多種商業(yè)蛋白酶水解菜籽蛋白，測得水解物的Zn2+螯合活性為33.35%～86.93%。以菜籽蛋白來源的活性肽ASH為基礎，利用多種金屬螯合活性較強的氨基酸（H、C、V、M、Y、D、Q、E、W）與其他氨基酸（A、G、I、L、F、S、T）進行C端、N端替換，設計合成一系列多肽，形成待試數(shù)據(jù)庫，采用18 種氨基酸描述符，利用PLS統(tǒng)計方法進行QSAR建模，揭示高螯合活性肽的結(jié)構(gòu)特征。利用兩端排序（two-terminal position numbering，TTPN）法將不同長度的多肽進行規(guī)格化，最大程度保留其結(jié)構(gòu)信息，使所有的樣品都能進行表征建模。最后，對菜籽源的虛擬水解肽進行活性預測，篩選出具有優(yōu)異螯合活性的小肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

系列合成肽 百意欣生物公司；鋅試劑、鋅標準溶液、無水乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；谷胱甘肽 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JA1103N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；ZD-85氣浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市精達儀器制造有限公司；HR801酶標分析儀 深圳市華科瑞科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鋅螯合肽數(shù)據(jù)庫的建立

測定人工合成的51 條三肽、5 條四肽（序列基于前期研究所獲的菜籽源鋅螯合活性肽ASH，ASH來源于菜籽蛋白的12S球蛋白序列中的f204～206碎片）的鋅螯合率[28]，形成待試數(shù)據(jù)庫。所有的數(shù)據(jù)按照2∶1隨機分配成校正集、預測集。

鋅螯合活性參照汪嬋等[28]的方法測定，其活性是相對于陽性對照的相對值。

1.3.2 氨基酸描述符數(shù)據(jù)庫的建立

查閱收集到的18 種氨基酸描述符分為兩類，見表1。

表1 氨基酸描述符Table1 Amino acid descriptors

1.3.3 TTPN法

由于多肽數(shù)據(jù)庫中包含了三肽和四肽，而QSAR建模需要多肽的長度相同，因此利用TTPN法將不同長度的多肽進行規(guī)格化，最大程度地保留其中的結(jié)構(gòu)信息，使所有的樣本都能進行表征建模。

TTPN法的原理是找到最短序列的肽，并以此為標準，從兩端將多肽各復制此長度的序列組成新的多肽。比如最短的為三肽，從兩端復制長度為3的序列，組合最終得到六肽，這樣最大限度的保留了兩端的氨基酸信息。TTPN法原理如下式所示。

式中：y表示活性；i為N或C端的氨基酸位置；j為氨基酸描述符變量的個數(shù)；Ni,j和Ci,j分別表示N端和C端第i個氨基酸第j個變量。

1.3.4 肽結(jié)構(gòu)特征變量矩陣的建立

氨基酸描述符是將氨基酸結(jié)構(gòu)信息經(jīng)過統(tǒng)計分析，壓縮變量維數(shù)，提取為幾個主成分。多肽結(jié)構(gòu)表征就是將多肽序列結(jié)構(gòu)用氨基酸描述符表示出一組特征參數(shù)，建立肽的結(jié)構(gòu)特征變量矩陣。對于三肽序列而言，變量總數(shù)為氨基酸描述符變量數(shù)目的3 倍。例如描述符Z含有3 個變量，則表征三肽的變量總數(shù)為3×3＝9。將鋅螯合肽數(shù)據(jù)庫中的每條肽序列從N端向C端表征，形成結(jié)構(gòu)特征變量矩陣X，同時活性數(shù)據(jù)形成矩陣Y。

1.3.5 PLS建模

采用PLS建模，模型的擬合能力通過累積決定系數(shù)R2和估計均方根誤差（root mean square error of estimation，RMSEE）評價。R2越高、RMSEE越低，擬合能力越好。同時，采用留一法對模型數(shù)據(jù)進行內(nèi)部驗證，評價其預測能力，最后計算交互驗證決定系數(shù)Q2。一個具有較高擬合能力和預測能力的模型應該具備的條件是：R2＞0.6，Q2＞0.5，對模型外部預測能力的評價是通過Qext2即外部驗證系數(shù)以及預測方根誤差（root mean square of prediction，RMSEP）。分析平臺為Matlab 7.6.0，所有的變量經(jīng)過中心化處理因而具有均等的權重，樣本數(shù)據(jù)庫自動隨機分配為校正集和預測集。對于校正集，使用交互驗證作為內(nèi)部驗證，主成分的個數(shù)是基于預測殘差平方和得出的。應用Hotelling’s T2和殘差分析兩種方式考察異常點。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋅螯合肽數(shù)據(jù)庫的建立

鋅螯合肽數(shù)據(jù)庫見表2。在QSAR建模過程中，所有的數(shù)據(jù)按照2∶1隨機分配成校正集、預測集，因此校正集數(shù)量為37，預測集數(shù)量為19。校正集用于建立QSAR模型，同時進行內(nèi)部驗證，而預測集用于外部驗證。

表2 鋅螯合肽數(shù)據(jù)庫Table2 Database of zinc-chelating peptides

2.2 鋅螯合肽氨基酸描述符以及QSAR模型的選擇

選擇合適的氨基酸描述符來描述不同種類、長度的多肽是建模過程中關鍵的一步，匹配的描述符能夠最大程度地保留序列中的有用信息。另外，采用PLS建模能夠有效解決變量之間的共線問題，即使樣本數(shù)量小于變量數(shù)量也可以分析。研究首先通過TTPN法將不同長度序列的多肽統(tǒng)一長度，經(jīng)過18 種氨基酸描述符表征量化，并用PLS建模，再通過Hotelling’s T2和殘差分析去除異常點后，最終的模型結(jié)果如表3所示。

對于一個具有良好擬合能力和預測能力的QSAR模型，相應的標準為：R2＞0.6、Q2＞0.5。從表3中可以看出18 種氨基酸描述符模型的相關系數(shù)，其中描述符Z、C、HESH、FASGAI、ST的模型的相關系數(shù)較好（R2為0.684 9～0.827 3；Q2為0.503 9～0.622 3），達到了R2＞0.6、Q2＞0.5的建模要求。

表3 使用18 種氨基酸描述符的QSAR模型Table3 QSAR models based on eighteen amino acid descriptors

同時，使用2D描述符普遍比使用3D描述符具有更好的相關系數(shù)和驗證結(jié)果。在2D描述符的模型中，Z（R2＝0.733 4，Q2＝0.622 3）、FASGAI（R2＝0.827 3，Q2＝0.602 2）描述符模型最優(yōu)，TEN描述符模型雖然具有較高的校正集累積決定系數(shù)（R2＝0.827 2），但是交互驗證系數(shù)（Q2＝0.413 0）不足以驗證模型具有良好預測能力。描述符Z、FASGAI、VHSE、TEN的X矩陣中包括了立體性、疏水性、電性3 個屬性，而HESH、DPPS的X矩陣在這3 個變量的基礎上增加了氫鍵屬性，其QSAR模型的相關參數(shù)有所降低。雖然Z和FASGAI在X矩陣中的屬性相同，但它們是從物理化學屬性的不同范圍中提取，因此具有不同的變量數(shù)目（Z：3；FASGAI：6）。另外，從相關系數(shù)上比較，描述符FASGAI的模型的擬合能力更好。但是，在3D描述符的模型中，只有C、ST符合建模要求，雖然C描述符模型的R2較小，擬合能力低于ST，但是模型的內(nèi)部和外部預測能力都高于ST。

圖1 使用5 種氨基酸描述符校正集的計算值和觀察值的相關關系Fig.1 Correlation between calculated and observed values of a calibration set using 5 amino acids descriptors

Z、C、HESH、FASGAI、ST這5 種描述符模型校正集的觀察值與計算值的相關關系結(jié)果如圖1所示，其中，圖1d是使用FASGAI氨基酸描述符的QSAR模型。雖然有系統(tǒng)誤差存在，但是對于37 個樣本量的校正集，模型擬合較好，大部分落在對角線附近。

2.3 QSAR模型對鋅螯合多肽能力的預測

預測集不參與QSAR模型的建立，僅用于模型的外部驗證，檢測模型的實際預測能力。表3顯示出使用FASGAI描述符的決定系數(shù)Q2ext為0.717 2、RMSEP為0.255 8，優(yōu)異于描述符Z、C、HESH、ST等相關系數(shù)，而其余的13 種描述符，其Q2ext均小于0.5，表明對應的QSAR模型不具備良好的預測能力。

圖2 使用5 種氨基酸描述符的預測集的預測值和觀察值的相關關系Fig.2 Correlation between predicted and observed values of a prediction set using 5 amino acids descriptors

圖2 形象表明了不同描述符模型的預測能力，顯示了預測值與觀察值之間的關系。其中，圖2d是使用FASGAI氨基酸描述符的QSAR模型的外部驗證效果。對于19 個樣本量的預測集，模型擬合較好，大部分落在對角線附近。基于以上的結(jié)果，使用FASGAI氨基酸描述符的QSAR模型最為優(yōu)良，因而FASGAI氨基酸描述符是最適合用于描述鋅螯合肽的結(jié)構(gòu)特征。

2.4 氨基酸描述符的屬性與活性之間的關系

在QSAR模型中，每個X變量對活性的貢獻大小可以通過測定變量投影重要性指標（variable importance in project，VIP）值和對應的回歸系數(shù)來判定[32]。

圖3 應用FASGAI氨基酸描述符的QSAR模型的VIP值圖Fig.3 VIP values of the QSAR model with FASGAI amino acid descriptor

描述符FASGAI有6 個變量，因此通過TTPN處理后得到的六肽總共有36 個變量（6×6＝36），表示為X1～X36。圖3表明使用描述符FASGAI模型各變量的VIP值，可見變量X15、X21、X9、X3、X33、X27、X14、X23、X19、X36、X6對變量Y有較大的貢獻（VIP值＞1）。上述11 個VIP值大于1的變量也可表示為N3,3（FASGAI描述符中N端第3個位置上第3個變量）、C3,3（FASFAI描述符中C端第3個位置第3個變量）、N2,3、N1,3、C1,3、C2,3、N3,2、C3,5、C3,1、C1,1、N1,6，因為每一個變量都表示了序列中氨基酸殘基的位置以及對應的理化屬性。

圖4 應用FASGAI氨基酸描述符的QSAR模型的回歸系數(shù)圖Fig.4 Regression coefficients of the QSAR model using FASGAI amino acid descriptor

圖4 是上述11 個變量的回歸系數(shù)圖，表明變量矩陣X與變量矩陣Y之間的正負相關性：除了X19（C3,1）與鋅螯合肽活性呈正相關性，其余X15（N3,3）、X21（C3,3）、X9（N2,3）、X3（N1,3）、X33（C1,3）、X27（C2,3）、X14（N3,2）、X23（C3,5）、X36（C1,1）、X6（N1,6）都與鋅螯合肽活性呈負相關性。

氨基酸描述符FASGAI包括3 個物化屬性：疏水性、立體性、電性，立體性又具體分為α轉(zhuǎn)角、立體屬性、綜合特性、局部彈性4 個屬性，表4展示了上述11 個變量在序列中的位置以及對應的物化屬性。

表4 數(shù)據(jù)庫經(jīng)過PLS回歸分析后的VIP值、回歸系數(shù)以及位置信息Table4 Important properties of the peptides after PLS regression analysis

表5 基于VIP值總和確定肽序列中位置及屬性重要性Table5 Importance of structural properties and positions based on calculated VIP values

為了更清楚地研究序列中氨基酸殘基的位置對鋅螯合肽活性的影響，將序列中每個位置上不同屬性的VIP值求和（表5）。C3的VIP值最高，表明了序列中C3的位置對活性的影響最大，其中包括了變量X21（C3,3）、X19（C3,1）、X23（C3,5），屬性貢獻大小依次是立體屬性＞局部彈性＞疏水性，再根據(jù)表4中對應的回歸系數(shù)，說明在C3位置上，低空間屬性[X21（C3,3）]、局部彈性[X23（C3,5）]和高疏水性[X19（C3,1）]的氨基酸殘基可能提高鋅螯合肽活性。N3的VIP值排在C3之后，其中有變量X15（N3,3），X14（N3,2），屬性貢獻大小依次是空間屬性＞α轉(zhuǎn)角，并且在N3位置上，低空間屬性[X15（N3,3）]、低α轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基可能提高鋅螯合肽活性。VIP值排在第三位的是C1，包括了變量X33（C3,1）、X36（C1,1），屬性貢獻大小為空間屬性＞疏水性，表明C1位置上，低空間屬性、低疏水性的氨基酸殘基可能有利于鋅螯合肽活性。第四位是N1，變量包括X3（N1,3）、X6（N1,6），貢獻大小為空間屬性＞電性，在N1位置上，低空間屬性、低電性的氨基酸殘基可能利于對鋅螯合肽活性。VIP值排在最后的分別是N2、C2，只有一個屬性空間屬性貢獻較大，說明在N2、C2位置上低空間屬性的氨基酸殘基對活性的預測有一定的作用。綜上可見，C3、N3在多肽序列中是主要影響鋅螯合活性的位置，其中較低立體屬性利于鋅螯合肽的活性。氨基酸微量元素鰲合物是以二價陽離子與給電子體的氨基酸成配位鍵，同時又與給電子體的羰基中的氧構(gòu)成離子鍵形成五元環(huán)或六元環(huán)，而較低的立體屬性可能能夠減少螯合的空間位阻。從直觀比對數(shù)據(jù)庫中56 條多肽的活性來看，含有絲氨酸和半胱氨酸的多肽活性較高，絲氨酸、半胱氨酸的R基分別是—CH2—OH、—CH2—SH，具有很低的空間屬性、空間位阻。

3 結(jié) 論

本研究采用18 種氨基酸描述符，利用PLS統(tǒng)計方法，對56 條合成肽進行統(tǒng)計分析。發(fā)現(xiàn)FASGAI、Z、HESH、C和ST這5 種氨基酸描述符對應的QSAR模型相關系數(shù)達到建模要求，其中描述符FASGAI相關系數(shù)最優(yōu)，R2＝0.827 3、Q2＝0.602 2、RMSEE＝0.168 6、＝0.717 2、RMSEP＝0.255 8。隨后，采用TTPN法對描述符FASGAI所構(gòu)建的模型進一步分析發(fā)現(xiàn)，在菜籽源肽多肽序列中，氨基酸位置對多肽鋅螯合活性的影響力為C3＞N3＞C1＞N1＞N2＞C2。結(jié)果初步表明了在菜籽源的鋅螯合肽序列中C3、N3、C1這3 個位置的重要性，而且各位置氨基酸立體屬性較低的多肽擁有較高的鋅螯合活性，這與直觀比對數(shù)據(jù)庫中56 條多肽活性的結(jié)論相似。