林偉明 王子晨 吳文敬 費文婷 張建軍 熊 平

(1 華南農(nóng)業(yè)大學制藥工程系，廣州，510640； 2 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京，100029)

阿薩伊(英文名：A?aí)，又名巴西莓，來源于棕櫚科植物阿薩伊棕櫚樹EuterpeOleraceaeMart.的新鮮果實。據(jù)當?shù)蒯t(yī)學記載[1-3]，阿薩伊在巴西亞馬遜流域地區(qū)被用作食物和治療多種疾病的草藥已有幾百年的歷史?，F(xiàn)代研究認為，阿薩伊有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗輻射損傷、降脂、降糖、解酒保肝等作用[4]，且富含多種營養(yǎng)成分，具有類似于我國中草藥的基本特征。

近十年來，隨著全球人口流動日趨頻繁，阿薩伊被引入中國，并在2013年被批準為新資源食品，但當前國內(nèi)對阿薩伊的研究還較少，已有的報道主要集中在抗氧化、對酒精性肝損傷和輻射損傷的防護作用[5-7]。盡管阿薩伊有獨特的藥用價值，但若將此種外來天然藥用資源融入到中草藥資源中，并有效推廣應用到臨床，仍要遵循中醫(yī)藥基礎理論，對阿薩伊開展“中藥化”研究，闡釋阿薩伊的藥性，而藥性中寒熱屬性則是要闡釋的關鍵問題。

關于中藥寒熱藥性的判別，近代探索基本建立在藥理藥效的差異上。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，中藥寒熱藥性的辨識研究方法漸趨多樣[8]。對于南美草藥阿薩伊的藥性分析上，目前王林元等學者[9]已通過動物體內(nèi)實驗，在藥理藥效差異方面作了較為深入的研究。而本研究采用細胞學的研究方法，通過同類比較阿薩伊以及傳統(tǒng)寒涼中藥黃柏對2種人肝癌細胞株HepG2和Hep3B在生長增殖和能量代謝等方面的影響，從體外角度論證阿薩伊的寒熱藥性，為阿薩伊藥性鑒別提供更多科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人肝癌細胞株HepG2，由廣東省疾病預防控制中心捐贈；人肝癌細胞株Hep3B，由暨南大學藥學院捐贈。

1.1.2 藥物 阿薩伊粉，產(chǎn)自巴西帕拉州，由北京中醫(yī)藥大學張建軍教授提供。黃柏配方顆粒(購于北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號：15015431)。

1.1.3 試劑與儀器 高糖型DMEM細胞培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；青鏈霉素雙抗、噻唑藍(MTT)、臺盼藍，北京普博欣生物科技有限公司；輔酶INAD(H)試劑盒，南京建成生物工程研究所；FC-18R臺式高速冷凍離心機，廣州市方統(tǒng)生物科技有限公司；Sim FD8-6P真空冷凍干燥機，西盟國際公司；新芝JY92-IIN超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Thermo HERAcell 240i全能型控溫濕CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo Varioskan Flash全波長多功能酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司，SkanIt RE for Varioskan Flash 2.4.3分析軟件；OLYMPUS IX51倒置生物顯微鏡，上海普赫光電科技有限公司；NIS-Elements F/Viewer圖像分析軟件，上海成貫儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.2 給藥方法

1.2.2.1 受試物前處理 阿莎伊前處理：將8 g阿薩伊粉溶解于80 mL滅菌純水中，4 ℃以10 000 r/min離心30 min，取上清液，按同法對沉淀重復處理1次，合并上清液，置于-80 ℃預凍24 h，然后真空冷凍干燥，48 h后收集凍干粉，密封，常溫保存。

黃柏前處理：精確稱取黃柏配方顆粒3.60 g，由20 g黃柏飲片制成(每1 g顆粒約相當于5.56 g飲片)，加水適量，煎煮3次，30 min/次，合并煎液，濃縮，在4 ℃以10 000 r/min離心30 min，收集上清液，其余操作同阿莎伊前處理。

1.2.2.2 受試溶液的配制 精確稱取100 mg經(jīng)前處理的阿薩伊和黃柏，分別溶于10 mL細胞培養(yǎng)基中，35 kHz功率超聲10 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，制備10 mg/mL濃度的阿莎伊和黃柏受試母液，1 mL滅菌離心管分裝，置于4 ℃保存。使用時，用細胞完全培養(yǎng)基將2種母液依次稀釋成100、40、20、10、5、2、1、0.5、0.25 μg/mL濃度梯度的受試液，4 ℃保存，用于細胞生長增殖試驗；另將二者受試母液分別稀釋為100、50、25 μg/mL濃度梯度的受試溶液，4 ℃保存，用于細胞能量代謝試驗。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 細胞復蘇與接種 將HepG2和Hep3B 2種人源肝癌細胞株復蘇，接種于9 cm培養(yǎng)皿上，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱孵育1 h，觀察細胞生長情況。24 h后若單層細胞覆蓋培養(yǎng)皿80%以上，進行細胞傳代。持續(xù)傳5代，至細胞生長、代謝穩(wěn)定，觀察細胞貼壁生長情況。

1.2.3.2 對細胞生長增殖的影響 1)分組與處理:實驗以黃柏受試溶液為陽性對照，分為8個不同濃度黃柏受試組、8個不同濃度阿薩伊受試組、空白對照組和調(diào)零組，除空白對照組和調(diào)零組設6個復孔外，其余各組3個復孔。取96孔板，200 μL培養(yǎng)液/每孔中接種104個細胞，將細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，每孔加入200 μL相應濃度受試溶液處理，空白對照組和調(diào)零組加入200 μL培養(yǎng)基，換液后繼續(xù)孵育48 h。2)細胞增殖抑制試驗:孵育48 h后，棄培養(yǎng)基，各組按180 μL/孔更換細胞培養(yǎng)基，同時每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，輕輕吹打混勻，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。取出細胞培養(yǎng)板，各孔棄去上清液后，加入150 μL DMSO，以60次/min的頻率震蕩10 min，采用酶標儀以檢測波長490 nm測定各孔吸光度(A)值，并計算細胞增殖抑制率(抑制率=(1-受試組A值÷空白對照組A值)×100%)。抑制率為正值，表示藥物對細胞增殖有抑制作用；抑制率為負值，表示藥物對細胞增殖有促進作用。實驗重復3次。3)細胞生長形態(tài)觀察:按“2.2.1”項下操作方法，細胞經(jīng)阿薩伊受試液處理48 h后，從37 ℃ CO2細胞培養(yǎng)箱中取出，各組按每孔200 μL更換細胞培養(yǎng)基，采用倒置相差光學顯微鏡4倍物鏡選定視野，于10倍物鏡下觀察并記錄各組細胞生長狀況及形態(tài)變化情況。4)臺盼藍染色排斥試驗:按“2.2.1”項下操作方法，細胞經(jīng)阿薩伊受試液處理48 h后，從37 ℃ CO2細胞培養(yǎng)箱中取出，各組每孔按180 μL更換培養(yǎng)基后，再加入20 μL 0.4%臺盼藍染液作用5 min，然后置于倒置相差顯微鏡4倍物鏡下選定視野，于10倍物鏡下進行鏡檢并拍照。

1.2.3.2 對細胞能量代謝的影響 1)分組與處理:取9 cm細胞培養(yǎng)皿進行試驗，實驗設置4個組，包括3個不同濃度的阿薩伊藥液受試組和空白對照組。當HepG2和Hep3B人源型肝癌細胞株處于對數(shù)生長期時，棄培養(yǎng)液，用胰酶消化洗脫，收集細胞懸液以1000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS洗滌細胞2～3次，1000 r/min離心10 min，棄洗液，用細胞培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1.5×106/L，充分混勻后接種于9 cm培養(yǎng)皿，每個皿所含細胞總數(shù)為3×106個細胞，接種后將細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，待觀察到細胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，每皿加入6 mL含相應濃度阿薩伊溶液的培養(yǎng)液，空白對照組加入6 mL細胞培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)皿置于CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。2)細胞NADH含量及NADH/NAD+比值的變化:按“輔酶I NAD(H)試劑盒說明書”的方法操作，提取2種細胞中的NADH和NAD+，分光光度法檢測并計算細胞中2種物質(zhì)的含量，以nmol/104 Cells表示，并計算NADH/NAD+比值。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 阿薩伊對細胞生長增殖的影響結(jié)果 實驗結(jié)果顯示，設置的8個濃度的阿薩伊溶液均對HepG2和Hep3B細胞株的生長增殖產(chǎn)生不同程度的抑制作用，抑制效果與陽性對照藥黃柏相似，表現(xiàn)在其抑制曲線隨受試濃度的增大總體上均呈現(xiàn)上升趨勢。而值得注意的是，阿薩伊對2種細胞株的抑制效應在低濃度均出現(xiàn)谷值，使該范圍曲線呈現(xiàn)類似“V”型的趨勢變化(如圖1，2所示)。從阿薩伊藥液對HepG2細胞株的劑量效應關系來看，當阿薩伊生藥濃度≤0.5 μg/mL的低濃度和(或)≥10 μg/mL的高濃度范圍時，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05；P<0.01)；從阿薩伊藥液對Hep3B細胞株的劑量效應關系看，則在阿薩伊生藥濃度≤1 μg/mL的低濃度以及≥5 μg/mL的高濃度范圍時，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05；P<0.01)，高濃度時與陽性對照組的抑制效應相一致，結(jié)果見表1，2所示。由此可見，阿薩伊對2種細胞株的作用效果一致，并都呈現(xiàn)以抑制為主的效應，這種效應現(xiàn)象符合程薇薇等學者[10]提出的寒性藥在高、低濃度給藥劑量下均抑制細胞增殖的表現(xiàn)，因此，在對細胞生長增殖上可以判斷阿薩伊的藥性偏寒涼。

2.2 阿薩伊對細胞生長形態(tài)的影響結(jié)果 光鏡觀察結(jié)果如圖3，4所示，未經(jīng)處理的空白對照組HepG2和Hep3B細胞呈現(xiàn)成片堆積于整個細胞培養(yǎng)皿底部，細胞間緊密交匯連接，形態(tài)多為類圓形，因接觸抑制脫落死亡的顆粒狀褶皺細胞殘骸隨處可見(Hep3B細胞尤為明顯)；而經(jīng)各濃度陽性藥液(黃柏)處理48 h的HepG2和Hep3B細胞數(shù)量均有明顯減少，細胞間連接明顯較空白對照組細胞疏松，生長空間充足使細胞呈扁平不規(guī)則多邊形鋪展，顆粒感減弱，呈類圓形細胞形態(tài)明顯少于未經(jīng)處理細胞，懸浮的細胞殘骸少見；經(jīng)各濃度阿薩伊溶液處理48 h的2種細胞株生長形態(tài)與黃柏溶液處理的基本一致，同時，2種細胞株的生長疏松程度也基本與MTT試驗中隨藥物濃度變化的結(jié)果相一致，≥10 μg/mL的高濃度阿莎伊組細胞顯示出更少的細胞數(shù)量，不規(guī)則性形態(tài)更為顯著，細胞稀疏散在生長。結(jié)果表明，在所設定濃度范圍內(nèi)，阿薩伊溶液對2種細胞株的作用與黃柏藥液的效應相似，對受試細胞株均呈細胞增殖抑制作用，劑量效應關系明顯。

表1 阿薩伊溶液對HepG2細胞增殖的影響

注：與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

表2 阿薩伊溶液對Hep3B細胞增殖的影響

注：與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖1 HepG2細胞增殖抑制率曲線

圖2 Hep3B細胞增殖抑制率曲線

2.3 阿薩伊對細胞株的毒性作用 臺盼藍染色排斥實驗結(jié)果如圖5，6所示，經(jīng)不同濃度陽性藥液處理的2種細胞株，經(jīng)臺盼藍染色后，染成藍色的細胞為顆粒狀的脫落細胞，其在數(shù)量上少于空白對照組，經(jīng)不同濃度阿薩伊溶液處理的2種細胞株染色情況與黃柏對照組基本一致。結(jié)果表明，阿薩伊溶液在所設濃度范圍內(nèi)對2種細胞株均無明顯毒性作用。

圖3 阿薩伊溶液對HepG2細胞生長和形態(tài)變化的影響(×10)

2.4 阿薩伊對細胞能量代謝的影響 細胞中NADH含量和NADH/NAD+比值的變化均能反映細胞糖酵解和三羧酸循環(huán)的強弱變化，即能量代謝變化情況。實驗結(jié)果如表3，4和圖7，8所示，3個受試濃度的阿薩伊溶液對HepG2和Hep3B 2種細胞株的NADH含量和NADH/NAD+比值均起到下調(diào)作用。其中，經(jīng)阿薩伊溶液處理后的細胞中NADH/NAD+比值與空白對照組細胞比較，3個受試濃度的阿薩伊溶液均顯著或極顯著地降低了2種細胞株的NADH/NAD+比值，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。阿薩伊溶液的受試濃度與影響2種細胞中NADH含量和NADH/NAD+比值變化之間呈明顯的正相關，阿薩伊下調(diào)效應在高濃度尤為顯著。經(jīng)阿薩伊處理后，2個指標的下降，提示受試細胞的糖酵解和三羧酸循環(huán)減弱，細胞的能量代謝下降，此時細胞呼吸耗氧量降低，細胞生長增殖受抑制。

圖4 阿薩伊溶液對Hep3B細胞生長和形態(tài)變化的影響(×10)

圖5 HepG2細胞的臺盼藍染色結(jié)果(×10)

圖6 Hep3B細胞的臺盼藍染色結(jié)果(×10)

表3 阿薩伊溶液對HepG2細胞能量代謝的影響

注：與空白對照組比較,*P<0.05，**P<0.01

圖7 HepG2細胞能量代謝變化

組別NADH含量/nmol·(104 Cells)-1NADH/NAD+空白對照組0.022±0.0112.225±0.06625 μg/mL阿薩伊組0.008±0.005*0.596±0.336**50 μg/mL阿薩伊組0.012±0.0030.652±0.283**100 μg/mL阿薩伊組0.004±0.005**0.154±0.136**

注：與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖8 Hep3B細胞能量代謝變化

3 討論

細胞學方法評價寒熱藥性基于藥物效應特征，以細胞為材料，具有組間差異小，均一性強、重現(xiàn)性好的優(yōu)點，并利于結(jié)合蛋白和基因表達差異、熱動力學(能量)分析等方法，克服了整體動物實驗個體差異明顯，指標波動性大、實驗周期長等缺陷。國內(nèi)程薇薇等人[10]較早將細胞學方法用于藥性的寒熱分析，根據(jù)藥物作用于細胞上的藥效表現(xiàn)(如細胞增殖、生長狀態(tài)等)來判別未知藥性藥物的寒熱屬性，提出了“熱性藥低濃度促進細胞生長、代謝和增殖，高濃度產(chǎn)生細胞毒性；寒性藥低濃度則可產(chǎn)生無明顯細胞毒性的抑制效果”的評價標準[10]。當前，還沒有人采用細胞學方法對阿薩伊開展寒熱藥性的相關研究，因此，本文借鑒了中藥藥性研究的細胞模型方法[10-11]，從另一個角度對阿薩伊的藥性進行判別評價。

阿薩伊凍干粉為混合成分，針對其經(jīng)前處理仍存在植物藥特有褐色的問題，因此在實驗受試劑量選取上進行了考察，預實驗對1～400 μg/mL濃度梯度的阿薩伊藥液進行了比色分析，選取了濃度間藥液顏色差異小，濃度較低的0.25～40 μg/mL，以減少藥物殘留于貼壁細胞層造成顏色差異所帶來的實驗誤差[12]，并可排除熱性藥濃度過高時的細胞毒性作用所造成的假陽性結(jié)果[10]，臺盼藍染色排斥試驗結(jié)果說明，在0.25～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)阿薩伊對腫瘤細胞的增殖抑制并不由細胞毒性所致。

阿薩伊的寒熱藥性經(jīng)其傳統(tǒng)應用推理為寒性[4]。王林元等通過動物實驗，以地塞米松磷酸鈉和氫化可的松琥珀酸分別對SD大鼠進行虛熱和虛寒病證體質(zhì)造模，檢測造模并給藥后大鼠血清中內(nèi)分泌激素(T3，T4，rT3)、環(huán)核苷酸(cAMP，cGMP)和代謝標志物(TP，UA，TC，TG，ALB)等反映機體產(chǎn)熱和代謝變化的生化指標，結(jié)合大鼠體重、毛色、精神狀態(tài)、自主活動、寒熱溫度耐受及大便情況等改變，對比陽性藥的作用，以同類比較、異類反證法驗證了理論推導的阿薩伊的偏寒藥性[9]。隨后王子晨等也以同樣的方法造模，基于大鼠血清當中的環(huán)核苷酸，去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、多巴胺β羥化酶(D-β-H)等神經(jīng)遞質(zhì)及相關酶，以及免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補體C3(C3)、補體C4(C4)等免疫分子水平的變化和大鼠體征變化，也從阿薩伊對模型鼠精神亢奮程度(神經(jīng)系統(tǒng))、體質(zhì)和抗邪能力(免疫系統(tǒng))以及在兩系統(tǒng)間起媒介作用的第二信使的改善和調(diào)節(jié)作用中證實了阿薩伊的寒藥偏性[13]。

同一中藥藥材往往會因提取方法的不同而導致其化學組成或指紋圖譜發(fā)生改變，而藥材的化學組成作為藥物產(chǎn)生藥效的基礎，又與其藥性尤其是寒熱藥性密切相關[14]，所以提取方法會影響到藥物的藥性。在本實驗中，阿薩伊受試藥液以水為溶媒制備而成，未經(jīng)過炮制加工處理，跟通常水提或煎煮使用方法相一致，基本保留了阿薩伊的主要化學成分，因此，本文以細胞學方法表征阿薩伊受試溶液的寒熱藥性可以代表南美草藥阿薩伊本身的寒熱藥性。同時，本實驗對陽性對照藥物黃柏選用一致的藥液制備方法、受試濃度范圍和實驗操作流程進行相關測試。黃柏在傳統(tǒng)中藥里面被公認為寒性藥物，其性苦、寒，在本次實驗中顯示出其對人肝癌細胞株HepG2和Hep3B細胞增殖有顯著抑制作用，并具有劑量效應正相關性，兩細胞株的生長形態(tài)和染液排斥程度體現(xiàn)出寒性藥對細胞生長的作用特征[10]。而阿薩伊對2種人源肝癌細胞株的增殖、生長形態(tài)及臺盼藍染色排斥反應的作用結(jié)果，則完全符合這種寒性藥所體現(xiàn)的作用特征[10]，提示阿薩伊的藥性偏寒涼，對細胞毒性作用不明顯，這與其傳統(tǒng)應用推理和動物體內(nèi)實驗的結(jié)果[4,9,13]相一致。

另外，機體整體表征的產(chǎn)能產(chǎn)熱變化為藥物寒熱藥性的重要反映指標，熱性藥表現(xiàn)為機體興奮作用，能量代謝和產(chǎn)熱均被促進，而寒性藥則表現(xiàn)為與此相反的抑制作用[8]。在細胞能量代謝上，經(jīng)阿薩伊處理的2種模型細胞，其NADH含量和NADH/NAD+比值均明顯下降，提示細胞功能活動下降，能量代謝降低。NADH是生物功能性分子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶I)的還原態(tài)，產(chǎn)生于糖酵解和三羧酸循環(huán)，它作為電子供體進一步參與到機體能量代謝過程中呼吸鏈的電子傳遞以及氧化磷酸化產(chǎn)生大量ATP的重要環(huán)節(jié)[15],由于氧化磷酸化為真核生物主要的產(chǎn)能產(chǎn)熱過程，檢測細胞中NADH的含量可間接反映糖酵解和三羧酸循環(huán)的強弱以及細胞能量代謝的活躍程度。NADH/NAD+比值不受NADH的含量差異的限制，可更有效反映細胞內(nèi)能量代謝情況。該項檢測同樣可印證阿薩伊的寒藥特性。

總之，本研究以同類比較法對比考察了阿薩伊對2種人源肝癌細胞株HepG2和Hep3B的細胞增殖影響，獨立分析了其對兩細胞株能量代謝影響的可能機制，綜合認為阿薩伊具有寒涼的中藥藥性。在中藥化學應用方面，阿薩伊可在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的指導下，單獨或配伍運用到治療熱證疾病中，可改善機體的熱證癥狀，具體的應用還需在臨床中不斷總結(jié)和驗證。