補(bǔ)益心脾對(duì)產(chǎn)后抑郁癥大鼠模型Th1/Th2平衡細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的影響

2018-11-29 02:02:58趙瑞珍李凈婭楊歆科唐啟盛

世界中醫(yī)藥 2018年11期

王丹趙瑞珍曲淼李凈婭楊歆科唐啟盛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京,100029)

產(chǎn)后抑郁癥(Postpartum Depression，PPD)是目前常見(jiàn)的繼發(fā)性抑郁癥之一。在國(guó)外發(fā)病率高[1-2]，國(guó)內(nèi)發(fā)病11.00%～23.25%[3]。由于患者產(chǎn)后處于哺乳期的特點(diǎn)，西藥治療有一定不良反應(yīng)，而中醫(yī)藥療法則具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4-8]，自擬參芪解郁方通過(guò)改善調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化,達(dá)到治療PPD的作用。近年來(lái)，隨著抑郁癥的免疫學(xué)病因的逐步揭示，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫平衡在妊娠期母體生殖免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而PPD發(fā)病與T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。本研究擬采用激素注射后突然停撤法大鼠模型，進(jìn)一步探討PPD發(fā)病過(guò)程中機(jī)體免疫器官與免疫分子的改變，通過(guò)觀察T細(xì)胞亞群及其表面分化抗原Th1、Th2的水平，闡釋PPD發(fā)病過(guò)程中由T細(xì)胞免疫失衡介導(dǎo)免疫功能紊亂的機(jī)制；同時(shí)應(yīng)用補(bǔ)益心脾中藥參芪解郁方進(jìn)行干預(yù)，明確該方劑對(duì)于PPD大鼠免疫系統(tǒng)T細(xì)胞亞群及其表面分化抗原的干預(yù)調(diào)節(jié)機(jī)制，近一步完善補(bǔ)益心脾法治療PPD的中醫(yī)藥理論體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物選取健康雌性SD大鼠90只，2月齡，SPF級(jí)，體重(200±10)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001),相對(duì)濕度：60%～70%，室溫：20～22 ℃，光照周期：12 h(7:00-19:00)，室內(nèi)安靜。

1.1.2 藥物參芪解郁方(黨參12 g、郁金15 g、黃芪20 g等)配方顆粒來(lái)源北京康仁堂藥業(yè)有限公司；鹽酸氟西汀膠囊(禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)：2090A)，20 mg；杭州動(dòng)物藥品廠苯甲酸雌二醇注射液(批號(hào)：140429)，上海通用藥業(yè)股份有限公司黃體酮注射液(批號(hào)：131014)。

1.1.3 試劑與儀器北京博蕾德生物科技有限公司PBS稀釋液，天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司外周血淋巴細(xì)胞分離液，美國(guó)Biolegend公司的Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A)、Alexa Fluor? 647 anti-rat CD3，F(xiàn)ITC anti-rat CD4，PerCP anti-rat CD8a，PE anti-rat IFN-gamma，PE anti-rat IL-4，Cell staining Buffer，F(xiàn)ixation Buffer，Permeabilization Wash Buffer，杭州四季青生物工程材料有限公司胎牛血清；RPMI-1640培養(yǎng)基。

大鼠曠場(chǎng)測(cè)試箱：規(guī)格為80 cm×80 cm×40 cm，木質(zhì)材料，底部及箱子內(nèi)壁為黑色，底部分為25塊等大方格(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中診教研室)。OLYMPUS CKX41SF倒置式顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、強(qiáng)迫游泳水缸：規(guī)格為高60 cm、直徑25 cm的圓柱玻璃缸(自購(gòu))。流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，F(xiàn)ACS Calibur Flow Cytometer System型)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備購(gòu)入大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行敞箱測(cè)試(Open-Field Test,OFT)，根據(jù)評(píng)分結(jié)果篩選合格動(dòng)物隨機(jī)分正常組、模型組、中藥組、西藥組、假手術(shù)組，分別灌胃1、2、4周，每時(shí)間點(diǎn)每組6只。分組完成后，根據(jù)激素模擬妊娠狀態(tài)突然停撤法[9](Hormone-simulated Pregnancy，HSP)制備模型。模型組、中藥組、西藥組(切除雙側(cè)卵巢)，假手術(shù)組(只摘除大鼠卵巢周圍少許脂肪)，進(jìn)行陰道涂片篩查挑選去勢(shì)手術(shù)合格動(dòng)物，前16 d對(duì)卵巢完全切除的大鼠皮下注射雌二醇注射液0.1 mL(2.5 μg)/d、黃體酮注射液0.2 mL(4 mg)/d，后7 d注射雌二醇注射液0.1 mL(50 μg)/d，于第24天停止注射；而假手術(shù)組在前16 d皮下注射芝麻油(0.3 mL/d)，后7 d注射芝麻油(0.1 mL/d)。

1.2.2 干預(yù)藥方法在造模結(jié)束后對(duì)其進(jìn)行藥物干預(yù)，灌胃體積：1 mL/100 g。正常組、模型組及假手術(shù)組予以蒸餾水灌胃；西藥組給予鹽酸氟西汀膠囊(參照生藥量0.25 mg/mL溶進(jìn)蒸餾水，置于4 ℃冰箱備用，用前進(jìn)行加熱)；中藥組給予參芪解郁方(按成人用量的7倍估算大鼠用量，生藥配比為1.25 g/mL)；于1、2、4周分別進(jìn)行行為學(xué)觀察以及取材。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)：蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)：蔗糖水消耗量=測(cè)定前瓶質(zhì)量-測(cè)定后瓶質(zhì)量(g)。大鼠測(cè)試前均禁水24 h，再檢測(cè)其1 h內(nèi)蔗糖水(1%)的消耗量。

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：強(qiáng)迫游泳桶內(nèi)注水，保持水深35 cm左右，水溫24～25 ℃。將大鼠放入水中，使其游泳15 min，結(jié)束后拭干。第2天在相同時(shí)間和相同條件下，再將大鼠放入注水的強(qiáng)迫游泳桶中游5 min，記錄5 min中大鼠的靜止?fàn)顟B(tài)的時(shí)間。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：每次開(kāi)始時(shí)將大鼠放至中心格，使其自由活動(dòng)。記錄5 min內(nèi)大鼠的水平得分和垂直得分。其中水平得分為穿越的格數(shù)，以四肢都進(jìn)入方格內(nèi)為準(zhǔn)；垂直得分為直立次數(shù)，以兩前肢均需離地為準(zhǔn)。為避免上次測(cè)試的大鼠殘留信息如大小便、氣味影響測(cè)試結(jié)果，大鼠檢測(cè)完畢后使用70%乙醇清洗曠場(chǎng)箱的內(nèi)壁及底面。

造模后1、2、4周觀察模型組與正常組、假手術(shù)組行為學(xué)變化，明確造模成功；同時(shí)觀察中藥組、西藥組對(duì)大鼠行為學(xué)變化的影響。

2)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1、Th2的細(xì)胞比例：在麻醉的情況下，取4 mL新鮮大鼠腹主動(dòng)脈血液，離心棄血漿后再加磷酸鹽緩沖液(PBS)2 mL，混勻；取15 mL的離心管并加入5 mL淋巴細(xì)胞分離液，再以2 500 r/min速度離心20 min，吸取淋巴細(xì)胞層，使用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，棄掉上清液；然后取外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)懸液100 μL；在每管加入Per CP抗大鼠CD4 2 μL，混勻后避光孵育30 min；把1×Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A)4 μL和RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL放入5%CO2，37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)6 h；再入Cell Staining Buffer，2 mL；以2 000 r/min速度，離心5 min，4 ℃，去掉上清液，加Fixation Buffer0.5 mL后避光20 min并離心，2 000 r/min速度，持續(xù)5 min，4 ℃，去上清液；再加2次1×Permeabilization Wash Buffer1 mL；以2 000 r/min速度，離心5 min，4 ℃，棄上清液；加PE抗大鼠IL-4，2 μL和FITC抗大鼠IFN-γ，2 μL；避光靜置，20 min并洗滌2次，Cell Staining Buffer2 mL；以2 000 r/min速度離心，持續(xù)5 min，4 ℃，去上清液再加1%多聚甲醛0.2 mL,固定，用錫紙包好待檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測(cè)

2.1.1 蔗糖水消耗量測(cè)試各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠蔗糖水消耗量均較正常組、假手術(shù)組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各時(shí)間點(diǎn)中藥組、西藥組大鼠蔗糖水消耗量均較模型組有所升高，且2周、4周中藥組、西藥組較同時(shí)間點(diǎn)模型組升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，1周中藥組大鼠蔗糖水消耗量較模型組雖有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，1周西藥組大鼠蔗糖水消耗量較同時(shí)間點(diǎn)模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.1.2 強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較各個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(Forced Swimming Test，F(xiàn)ST)不動(dòng)時(shí)間均較假手術(shù)組和正常組明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組、西藥組大鼠FST不動(dòng)時(shí)間各時(shí)間點(diǎn)均較模型組減少，2周、4周中藥組、西藥組較同時(shí)間點(diǎn)模型組減少明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，雖然2周中藥組、西藥組的不動(dòng)時(shí)間明顯減少，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但4周的中藥組和西藥組大鼠不動(dòng)時(shí)間與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，1周中藥組和西藥組大鼠FST不動(dòng)時(shí)間較模型組雖有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與1周正常組、假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。