李利軍,盧美歡，馬英輝，郭邦利，鄭建芳，張百忍，王小海

(1.陜西省微生物研究所，西安 710043；2.安康市農(nóng)業(yè)科學研究所，陜西安康 725021；3.西安工程大學 環(huán)境與化學工程學院，西安 710048；4.北京瑞芬生物科技股份有限公司，北京 100192)

魔芋又名鬼芋、蒟蒻等，具有重要的藥用、保健功能及觀賞價值。魔芋塊莖富含葡甘聚糖 (KGM)，可廣泛用于食品、醫(yī)療、化工、造紙、紡織、石油等行業(yè)，被稱為“東方魔粉”[1]。中國是魔芋生產(chǎn)大國，占世界總產(chǎn)量60%，魔芋精粉年產(chǎn)量約為1.5萬t。其中，陜南秦巴山區(qū)的魔芋適生區(qū)面積約占全國魔芋適生區(qū)總面積的1/3，特別是以漢中、安康為代表，已成為區(qū)域特色經(jīng)濟的主導產(chǎn)業(yè)[2]。

隨著陜南魔芋種植面積的逐年增加，白絹病發(fā)病率亦不斷增加，成為繼軟腐病后的第二大病害。由于白絹病菌核抗逆性強，能在土壤中存活多年，在連續(xù)發(fā)病的田塊，菌核數(shù)量不斷增加，發(fā)病風險也隨之不斷上升。白絹病病原菌通過分泌細胞壁降解酶使魔芋發(fā)病，一般7月上旬開始發(fā)病，8、9月達到高峰期。目前常用化學藥劑進行防治，據(jù)報道，丙環(huán)唑、烯唑醇對鳶尾白絹病有很好的抑制效果[3]，16%井岡·噻呋SC、苯甲·嘧菌酯對鐵皮石斛白絹病菌絲生長抑制率達100%[4-5]。在生防菌劑防治方面，有研究表明解淀粉芽孢桿菌對花生白絹病有較好防效[6]，綠色木霉分泌的幾丁質(zhì)酶對白絹病有一定的防治效果[7]。化學藥劑和生防菌劑復配對茉莉白絹病也有較好的防治作用[8]。利用中藥提取物進行白絹病防治尚未見相關報道。為此，本研究在對陜南魔芋白絹病的病原菌進行分離鑒定、并研究其生物學特性的基礎上，探究不同中藥提取物對白絹病病原菌的抑制性能，為白絹病的新藥篩選和綠色防控提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

魔芋白絹病發(fā)病組織采自安康市農(nóng)科所魔芋種植基地、漢中勉縣魔芋種植基地，共收集到發(fā)病植株12份。發(fā)病魔芋均表現(xiàn)為莖部褐變腐爛，布滿白色菌絲或白色至深棕色菌核。

厚樸酚(90%)、和厚樸酚(90%)、胡椒堿(95%)、蛇床子(35%)由北京瑞芬生物科技股份有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g,瓊脂18 g,水1 000 mL，自然pH。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.3 病原菌分離

將白絹病魔芋發(fā)病組織表面沖洗干凈，用無菌濾紙吸干多余水分，將發(fā)病組織切成直徑約1 cm 的小塊，置于無菌濕濾紙上30 ℃下恒溫培養(yǎng)，待菌絲長出后，挑取菌絲轉接于PDA平板。采用菌絲尖端切割法進行菌株分離純化，獲得單菌落。

1.4 致病性試驗

采用盆栽魔芋植株測定白絹病病原菌的致病性。健康魔芋葉柄基部接種部位用滅菌針穿刺5 個小孔。在純培養(yǎng)4 d 后的菌落邊緣打孔取直徑為10 mm 的菌餅，接種到葉柄的小孔上，蓋濕潤棉球保濕。設置3個重復。對照用濕潤棉球直接覆蓋于葉柄小孔上，噴無菌水保濕。在25 ℃條件下培養(yǎng)，如接種部位褐化、腐爛，并出現(xiàn)白色絹狀菌絲，表現(xiàn)為典型白絹病癥狀，則對病部重新進行病原菌分離培養(yǎng)。

1.5 ITS DNA 的擴增、序列測定和比對分析

采用檢測通用引物ITS1/ITS4。ITS1：5′ -TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3′，ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′。

PCR反應體系：10×Buffer 2 μL，Template 1 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP 0.5 μL，TransStartTaqPolymerase 0.2 μL，加ddH2O至20 μL。

PCR循環(huán)參數(shù)： 95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共9個循環(huán)；95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共34個循環(huán)；72 ℃修復延伸5 min。

PCR膠回收，連接入pGM-T載體中并轉化至宿主菌DH5α，涂布于LB/Amp+/X-Gal/IPTG平板上進行藍白篩，挑選白色克隆做菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳驗證菌落PCR，挑取陽性克隆培養(yǎng)，送交上海生工生物工程公司測序。ITS rDNA 序列在BLAST上比對。

1.6 不同溫度對白絹病菌絲生長、菌核萌發(fā)的影響

將白絹病病原菌接種在PDA培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)5 d，用打孔器取直徑為6 mm的菌餅，接種至PDA培養(yǎng)基，分別在4 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃恒溫培養(yǎng)。設3個重復，每隔12 h用十字交叉法測定菌落直徑。

將白絹病病原菌接種在PDA培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)10 d至菌核形成，取菌核放置于PDA培養(yǎng)基中央，每皿一個菌核，分別在4 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃恒溫培養(yǎng)。設3個重復，每隔12 h用十字交叉法測定菌落直徑。

1.7 不同pH對白絹病菌絲、菌核生長的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)整至4、5、6、7、8、9、10，接種方法和測量方法同“1.7”。

1.8 不同中藥提取物對白絹病菌絲、菌核生長的抑制作用[9]

將不同中藥提取物用無菌水配成50 mg/mL母液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，PDA培養(yǎng)基加熱融化，冷卻至50 ℃后混合藥物，配成終質(zhì)量濃度為5 mg/mL帶藥培養(yǎng)基，倒平板，接種白絹病菌餅或菌核，28 ℃恒溫培養(yǎng)，采用菌絲生長速率法，定時用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3個重復，同時做空白對照。

菌落凈直徑=菌落直徑-菌餅直徑

抑制率=(1-試驗組菌落凈直徑/對照組菌落凈直徑)×100%

1.9 中藥提取物最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定[10]

設置不同濃度的加藥培養(yǎng)基，將菌餅接種至培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)，12 h無菌絲生長的濃度即為MIC值，72 h無菌絲生長的濃度即為MBC值。

2 結果與分析

2.1 魔芋白絹病病原菌的分離及鑒定

從發(fā)病魔芋地塊收集白絹病發(fā)病組織，進行病原菌分離，共獲得6株純菌。挑取菌絲分別接種在魔芋塊莖和魔芋植株上，進行致病性檢測，結果顯示，其中4株菌均能使魔芋產(chǎn)生白絹病癥狀。菌株BJ1致病力最強，接種在魔芋塊莖后，2 d即開始腐爛，后期整個塊莖長滿白色菌絲。接種在植株上，魔芋表現(xiàn)出典型的白絹病癥狀，先是莖部腐爛，然后在接種部位陸續(xù)長出白色絲狀菌絲，進而長滿白色至黃褐色菌核(圖1)。從發(fā)病的組織和植株中又分離得到病原菌，證實該菌為魔芋白絹病病原菌。

2.2 病原菌菌種鑒定

2.2.1 菌落形態(tài) PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌絲白色絹絲狀，呈發(fā)散性生長，生長速度較快，48 h即能長滿培養(yǎng)皿，5～7 d開始菌絲扭結成菌核，菌核逐漸由白色變成深褐色堅硬外殼(圖2)，參考常用有關真菌的分類鑒定資料，與半知菌亞門真菌齊整小核菌形態(tài)相似[11-12]。

圖1 魔芋感染白絹病癥狀Fig.1 Symptoms of Amorphophallus konjac infected with southern blight pathogen

圖2 氣生菌絲(左)、菌核形成過程(中)和菌核(右)Fig.2 White mycelia(left),sclerotinia formation process(middle) and brown sclerotia ( right)

2.2.2 ITS rDNA鑒定 提取菌株基因組DNA，進行ITS rDNA PCR擴增，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗證，共獲得686 bp(圖 3)。PCR產(chǎn)物回收連接、轉化，挑取陽性克隆培養(yǎng)，送交上海生工生物工程公司測序。每個產(chǎn)物用ABI3730XL測序儀測兩個反應，再對結果進行拼接。測得ITS rDNA序列，在BLAST上進行序列比對，菌株鑒定為Atheliarolfsii(半知菌亞門真菌齊整小核菌)，相似度為99%。

2.3 病原菌生長特性

2.3.1 生長的溫度范圍 將病原菌BJ1的菌核和菌絲分別在4 ℃、10 ℃、15 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃和40 ℃溫度下進行培養(yǎng)，測定菌落直徑。結果表明，菌絲與菌核在10～40 ℃都可生長，最適生長溫度和萌發(fā)溫度均為30 ℃，菌絲在15～37 ℃生長速率無明顯差異(表1)。菌核在25～37 ℃能快速萌發(fā)并生長(表2)，較低溫度(10 ℃以下)和較高溫度(37 ℃以上)均能抑制菌絲萌發(fā)。

2.3.2 生長的pH范圍 白絹病病原菌分別在pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9和pH10條件下進行培養(yǎng)。結果表明，白絹病菌絲和菌核在pH為4～10時均能生長，酸性或堿性環(huán)境對菌絲生長無明顯影響，菌絲最適生長pH為7(表3)，菌核在pH 6～8生長較好，最適萌發(fā)和生長pH均為8，pH小于5或大于8時抑制菌核生長(表4)。

圖3 病原菌DNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Patterns of soft rot bacteria DNA

2.4 魔芋白絹病中藥提取藥物的篩選

通過用藥組和對照組比較，4種中藥提取物對魔芋白絹病病原菌均有抑制作用。中藥提取物在PDA培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度均為5mg/mL時，對白絹病菌菌絲的抑制試驗顯示(表5)，厚樸酚、和厚樸酚的效果最好，均能完全抑制白絹病菌絲的生長，各個階段抑制率為100%。蛇床子抑制效果次之，在菌絲萌發(fā)的初始階段抑制效果較好，隨著時間增長抑制率降低，72 h時抑制率為59.24%。胡椒堿也有一定的抑制作用。對菌核萌發(fā)的抑制試驗顯示(表6)，4種中藥提取物均不能完全抑制菌核萌發(fā)，但對菌核萌發(fā)后的菌絲生長有很好的抑制作用，厚樸酚、和厚樸酚、蛇床子的抑制率分別為74.73%、83.74%和88.14%。可見，中藥提取物對菌絲生長有很好的抑制作用，但較難透過菌核堅硬的外殼屏障，抑制其萌發(fā)。菌絲受藥物影響，變得膨大粗壯，分支增多，菌絲彎曲并扭結成團(圖4和圖5)，推測其抑菌機制可能是破壞細胞壁，使菌絲畸形，并阻礙菌絲的細胞壁、細胞膜形成。根據(jù)以上結果，進一步對抑制效果較好的厚樸酚、和厚樸酚進行毒力測定，厚樸酚抑制白絹病菌菌絲生長的MIC為30 μg/mL，MBC為50 μg/mL。和厚樸酚抑制白絹病菌菌絲生長的MIC為20 μg/mL，MBC為40 μg/mL。

表1 病原菌BJ1菌絲在不同溫度的生長情況(72 h菌落直徑)Table 1 Effects of temperatures on growth of Amorphophallus konjac southern blight pathogen BJ1(72 h colony diameter)

注：數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，大小寫字母經(jīng) Duncan 氏新復極差法檢驗在0.01、0.05水平差異顯著。下表同。

Note: Data in the table indicate “mean±SE”.Different uppercase or lowercase letters in the same column indicate significant difference atP<0.01 orP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test.The same below.

表2 病原菌BJ1菌核在不同溫度的萌發(fā)情況(菌落直徑)Table 2 Effects of temperatures on sclerotia germination of Amorphophallus konjac southern blight pathogen BJ1

注：數(shù)據(jù)為菌落直徑，單位為mm。表4同。

Note:Data was colony diameter，unit was mm.The same as table 4.

表3 病原菌BJ1菌絲在不同pH的生長情況(72 h菌落直徑)Table 3 Effects of pH on growth of Amorphophallus konjac southern blight pathogen BJ1(72 h colony diameter)

表4 病原菌BJ1菌核在不同pH的萌發(fā)情況Table 4 Effects of pH on sclerotia germination of Amorphophallus konjac southern blight pathogen BJ1

表5 不同中藥提取物對魔芋白絹病病原菌菌絲在不同生長階段的抑制Table 5 Inhibition of different Chinese medicine extracts on mycelium of Amorphophallus konjac southern blight pathogen at different growth stages

表6 不同中藥提取物對魔芋白絹病病原菌菌核在不同生長階段的抑制Table 6 Inhibition of different Chinese medicine extracts on brown sclerotia of Amorphophallus konjac southern blight pathogen at different growth stages

CK.對照 Control;1.厚樸酚 Magnolol;2.和厚樸酚 Honokiol;3.胡椒堿 Piperine;4.蛇床子 Cnidium;A.對菌絲的抑制 Inhibition on mycelium；B.對菌核的抑制 Inhibition on brown sclerotia

圖5 厚樸酚對白絹病病原菌菌絲形態(tài)的影響(超景深三位顯微鏡觀察，左：對照組；右：處理組) Fig.5 Effect of magnolol on mycelial morphology of Amorphophallus konjac southern blight pathogen (observed by super depth of field three microscope,left: control group; right: treatment group)

3 討論與結論

白絹病又稱菌核性根腐病和菌核性苗枯病，1891年，美國弗羅里達州首次報道番茄白絹病[13]。白絹病病原菌寄主范圍很廣，已報道的寄主包括100 多科中的 200 多種植物，是一種危害性很強的土傳性病害[14]。本研究對分離得到的魔芋白絹病病原菌進行形態(tài)學和ITS序列分析，鑒定為Atheliarolfsii(半知菌亞門真菌齊整小核菌，無性世代為齊整小核菌Sclerotiumrolfsii)，與徐煒[15]、馬瓊等[16]研究結果一致。王雅等[17]報道芝麻白絹病病原菌適宜生長溫度為22～34 ℃，最適生長溫度為31 ℃；在pH為4.0～9.0時均可生長，最適pH為6.5～7.0。茹水江等[18]認為白術白絹病菌菌絲生長、菌核產(chǎn)生和萌發(fā)的最適溫度均為30 ℃，菌絲在pH為4.0～6.0時生長最快，菌核萌發(fā)最適pH為5～7。本研究結果表明，魔芋白絹病菌絲與菌核在10～40 ℃都能生長，最適生長溫度和萌發(fā)溫度均為30 ℃，菌絲和菌核生長的pH為4～10，酸性或堿性環(huán)境對菌絲生長無明顯影響，菌絲最適生長pH為7，菌核最適萌發(fā)和生長pH均為8。根據(jù)氣象數(shù)據(jù)顯示，魔芋適生區(qū)陜南年平均氣溫15 ℃左右，全年大部分時間白絹病菌絲都能快速萌發(fā)并生長，安康、漢中兩地平均pH為6.5～7.0[19-20]，也十分利于白絹病病原菌的生長，可見白絹病的防治困難較大。

中草藥源農(nóng)藥是一種毒性較低、對生態(tài)環(huán)境友好的農(nóng)藥，中國擁有100多種具有殺蟲和抗菌活性成分的中草藥資源[21]。本研究通過對比幾種中藥提取物對魔芋白絹病病原菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)厚樸酚與和厚樸酚有很好的抑制效果。厚樸是具有廣泛藥效功能的中藥，厚樸酚與和厚樸酚是厚樸的兩種主要活性成分，具有消炎抗菌、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用，在中醫(yī)中藥領域具有廣泛用途[22]。在植物病害防治方面也有少量報道，厚樸酚與和厚樸酚對水稻稻枯菌具有很好的抑制效果，半數(shù)有效濃度(EC50)為4.15～12.69 mg/kg[23]。和厚樸酚對水果采后致腐青霉菌和鏈格孢菌有較好的抑制作用[24]。本研究測得厚樸酚與和厚樸酚抑制白絹病病原菌的MIC分別為30 μg/mL和20 μg/mL，MBC分別為50 μg/mL和40 μg/mL。利用厚樸酚與和厚樸酚等中藥提取物，開發(fā)高效的植物源殺菌劑進行魔芋白絹病防治，有望改變白絹病難以防治的現(xiàn)狀，同時滿足環(huán)保低毒的要求，具有廣闊的市場前景。