馬 昭，楊 莉 ，劉曉婷，喬彥杰，張 靜，朱曉慶,谷新利

(石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

許多研究已經(jīng)證實(shí)中藥多糖具有抗腫瘤、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗應(yīng)激、抗病毒以及抗衰老等多種生物活性，促進(jìn)機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫等作用，同時(shí)多糖為天然產(chǎn)物，具有毒副作用小、無(wú)殘留及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，備受研究者的重視。近幾年發(fā)現(xiàn)中藥多糖免疫調(diào)節(jié)作用與TLRs 信號(hào)通路有關(guān)，能與細(xì)胞上特定的受體，如TLR2和TLR4特異性結(jié)合，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答[1-2]。目前， TLR介導(dǎo)通路一般分為MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和TRIF依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而TRIF依賴性途徑是TLR3和TLR4獨(dú)有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3]。

有研究表明不同個(gè)體間由于MHCⅡ基因多態(tài)性使得MHCⅡ 類分子接納與提呈抗原具有一定的選擇性，導(dǎo)致不同個(gè)體對(duì)同一抗原表現(xiàn)出免疫應(yīng)答強(qiáng)弱的差異[4]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，多糖類物質(zhì)是T細(xì)胞依賴性抗原之一，可以先通過胞吞途徑，再被MHCⅡ類分子處理和呈遞，最終被TCR識(shí)別，參與機(jī)體細(xì)胞的免疫，誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生[5]。本試驗(yàn)采用PCR-SSCP和RT-PCR方法，檢測(cè)中藥復(fù)方多糖(compound Chinese herbal medicinal polysaccharides，簡(jiǎn)稱cCHMPS)對(duì)不同 MHC B-LβⅡ基因型雞淋巴細(xì)胞TLR4信號(hào)通路的下游TRIF依賴性途徑主要元件的影響，探討雞TLR4信號(hào)通路在中藥多糖調(diào)節(jié)不同 MHC B-LβⅡ基因型雞淋巴細(xì)胞免疫功能過程中的變化，初步闡明中藥多糖調(diào)節(jié)雞免疫功能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

中藥復(fù)方多糖由黨參、山楂、熟地、何首烏、當(dāng)歸、茯苓和補(bǔ)骨脂等11味中藥組成，各單味藥均購(gòu)自石河子市醫(yī)藥公司；中藥復(fù)方多糖粗提取物是從中藥復(fù)方中采用水提-醇沉法提取，再經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附后獲得質(zhì)量百分比濃度為77.10%的精制復(fù)方多糖，即cCHMPS，用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將其配置成200、150、100 μg/mL的cCHMPS，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后4 ℃儲(chǔ)存，備用。

1.2 試 劑

雞外周血淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(購(gòu)自全式金公司)；DEPC(購(gòu)自上海生物工程公司)；PBS磷酸緩沖液，胎牛血清(購(gòu)自全式金公司)；SYBR Green熒光染料，RT-PCR試劑(購(gòu)自全式金公司)；雞新城疫疫苗(La Sota株，購(gòu)自普萊柯生物工程股份有限公司)；RNA、DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，RNAprep Pure Cell/Bacteria k-it(購(gòu)自北京田根生物工程公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取 500羽1日齡京紅1號(hào)蛋雞，購(gòu)自新疆昌吉某一孵化場(chǎng)。翅下靜脈采血每羽0.2 mL，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，-20 ℃冷凍保存。按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取雞全血DNA，4 ℃保存，備用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列(No.M29763.1)，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3′，下游引物：5′-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3′，擴(kuò)增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系為20 μL：10 μL 的2×RCRMix，2 μL模板DNA，上下游引物各0.5 μL，7 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，60.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸35 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 L PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3.4 淋巴細(xì)胞的分離 根據(jù)PCR-SSCP基因型分型結(jié)果將雞進(jìn)行分組，然后靜脈采集血液參照謝昆等[6]等的方法，用胎盤藍(lán)染色，在顯微鏡下計(jì)算活細(xì)胞的成活率，活細(xì)胞率>95%以上者用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.5 試驗(yàn)分組與細(xì)胞培養(yǎng) 用含20%的胎牛血清的培養(yǎng)液將分離得到的淋巴細(xì)胞調(diào)整為5×106個(gè)/mL。試驗(yàn)按不同基因型分組，每組設(shè)3個(gè)劑量組，每個(gè)培養(yǎng)皿加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入不同質(zhì)量濃度的cCHMPS，使終質(zhì)量濃度分別達(dá)到100、75、50、0 μg/mL，即高劑量組、中劑量組、低劑量組和對(duì)照組。將培養(yǎng)皿置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)16、24、32、48 h后收集細(xì)胞。

1.3.6 雞淋巴細(xì)胞總RNA提取 收集淋巴細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取淋巴細(xì)胞的總RNA。RNA純度檢測(cè)：檢測(cè)其OD260nm/OD280nm比值，其比值為1.8～2.0。

1.3.7 RNA反轉(zhuǎn)錄 將2 μL 5×gDNA Graser Buffer、1 μL gDNA Eraser、5 μL RNase Free Water、2 μL RNA模板混勻，42 ℃反應(yīng)2 min，迅速冰浴，即反應(yīng)液Ⅰ，最后將1 μL Prime Scriptrt MIXⅠ、1 μL RT Primer MIX、4 μL 5×Primscript buffer、4 μL RNase Free Water加入反應(yīng)液Ⅰ中，37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃加熱5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，取出EP管，-20 ℃貯存，備用。

1.3.8 cDNA的PCR反應(yīng)體系與程序TRIF、 IRF3、 IFN-β及 β-Actin基因的引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank報(bào)道的TRIF、 IRF3、 IFN-β及 β-Actin基因mRNA的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)RCR特異性引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Conditions of PCR and parameters of oligonucleotide primer pair

cDNA的PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，8 μL ddH2O 總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；-20 ℃保存。

1.3.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×TransStart○RTip Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA，8 μL ddH2O，20 μL體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s；退火15 s，72 ℃延伸10 s，共42個(gè)循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用 2-△△Ct法計(jì)算目的基因TRIF、 IRF3和 IFN-β的相對(duì)表達(dá)量。以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示結(jié)果。用 SPSS 17.0 軟件分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以P<0.05 作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，并且將對(duì)照組的mRNA的相對(duì)表達(dá)量設(shè)置為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 MHC B-LβⅡ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，

取所得PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增結(jié)果較好，片段長(zhǎng)度與預(yù)期大小一致，條帶清晰，無(wú)非特異性條帶，可直接進(jìn)行SSCP分析。

2.2 PCR-SSCP 分析

對(duì)所有DNA樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增片段有3種基因型，分別定義為AA(103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)(圖2)。

圖1 MHC B-LβⅡ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of MHC B-LβⅡ gene

1、6、8、10、12.BC基因型 BC genotype； 3、5.AA基因型 AA genotype；2、4、7、9、11、13.BB基因型 BB genotype

2.3 TRIF、 IRF3、 IFN-β和 β-Actin 擴(kuò)增結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的雞TRIF、 IRF3、 IFN-β和 β-Actin 基因的引物，以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別獲得320 bp、260 bp、120 bp的目的條帶(圖3)。

2.4 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同基因型雞TLR4信號(hào)通路下游TRIF依賴性途徑主要元件的影響

2.4.1 不同基因型雞淋巴細(xì)胞中TRIFmRNA的表達(dá)變化 由表2可知，與對(duì)照組相比，cCHMPS均能顯著促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞chTRIFmRNA的表達(dá)，但其表達(dá)量的最高峰在不同的時(shí)間段及不同基因型雞中最有效地提高TRIFmRNA表達(dá)量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，中、低劑量組雞淋巴細(xì)胞在各時(shí)間段TRIFmRNA表達(dá)量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，高劑量組在各時(shí)間段TRIF mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，低劑量組各個(gè)時(shí)間段TRIF mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

2.4.2 不同基因型雞淋巴細(xì)胞中 IRF3 mRNA的表達(dá)變化 由表3可知，與對(duì)照組相比，cCHMPS均能顯著促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞 chIRF3 mRNA的表達(dá)，但其表達(dá)量的最高峰在不同時(shí)間段及不同基因型雞中最有效地提高 IRF3 mRNA表達(dá)量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，中、低劑量組雞淋巴細(xì)胞在各時(shí)間段 IRF3 mRNA表達(dá)量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，高劑量組在各時(shí)間段 IRF3 mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，低劑量組各個(gè)時(shí)間段 IRF3 mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

圖3 chTRIF、chIRF3、chIFN-β和 β-Actin凝膠電泳圖Fig.3 Electrophoretic patterns of PCR product of chTRIF，chIRF3，chIFN-β and β-Actin gene

表2 中藥復(fù)方多糖對(duì)各基因型雞淋巴細(xì)胞TRIF mRNA表達(dá)的影響Table 2 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide on chicken TRIF mRNA expression level of each genotype

注：對(duì)照組的mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1，同基因型組中，同列數(shù)據(jù)標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Notes: Relative expression of mRNA in control group 1.In the same genotype group,different lowercase letters with the same date in columns are significant difference(P<0.05).The same below.

表3 中藥復(fù)方多糖對(duì)各基因型雞淋巴細(xì)胞 IRF3 mRNA表達(dá)的影響Table 3 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide onIRF3 mRNA expression level of each genotype chicken

2.4.3 不同基因型雞淋巴細(xì)胞中IFN-βmRNA的表達(dá)變化 由表4可知，與對(duì)照組相比，cCHMPS均能顯著促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞 IFN-β mRNA的表達(dá)，其表達(dá)量的最高峰在不同的時(shí)間段及不同基因型雞中最有效地提高 IFN-β mRNA表達(dá)量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，中、低劑量組雞淋巴細(xì)胞在24 h、32 h、48 h IFN-β mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，高劑量組在24 h、32 h、48 h IFN-β mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，低劑量組在24 h、32 h、48 h IFN-β mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。

表4 中藥復(fù)方多糖對(duì)各基因型雞淋巴細(xì)胞IFN-β mRNA表達(dá)的影響Table 4 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide on IFN-β mRNA expression level of each genotype chicken

3 討 論

3.1 中藥復(fù)方多糖對(duì)雞淋巴細(xì)胞TLR4介導(dǎo)的TRIF依賴性途徑的影響

生物進(jìn)化過程中先天性免疫系統(tǒng)是一種比較古老而保守的防御系統(tǒng)，是機(jī)體抵抗病原微生物的第一道防線。研究表明，宿主細(xì)胞可以通過特定的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)及不同類型的PAMPs ，而TLRs是宿主細(xì)胞主要的模式識(shí)別受體之一。多種病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern ，PAMPs)可被TLR識(shí)別，其中脂多糖可被TLR4識(shí)別進(jìn)一步啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)免疫信號(hào)分子的表達(dá)。TLR4分子主要表達(dá)于樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞膜上，其下游TRIF依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括TRIF、 IRF3以及IFN-β等因子[7]。TLR4可以通過TRIF介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即TRAM與TRIF結(jié)合，活化下游TRAF-6，然后激發(fā)IRF3，誘導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞因子、干擾素( IFN-α、IFN-β )以及共刺激分子的表達(dá)[8-9]。研究表明黃芪多糖(APS)在一定濃度下，可誘導(dǎo)體內(nèi)和體外 TLR4 表達(dá)增加， TLR4 表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)黏膜細(xì)菌感染的天然免疫功能，APS在細(xì)胞表面與TLR4直接相互作用，可能通過激活TLR4調(diào)節(jié)宿主免疫介導(dǎo)的TRIF依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[10-12]。

近年對(duì)雞TLR4的研究逐漸增多， Leveque等[13]研究發(fā)現(xiàn)chTLR4在沙門氏菌侵入雛雞機(jī)體過程中起著一定的保護(hù)作用；Ruili等[14]通過黃芪多糖影響雛雞免疫器官TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以激活雛雞法氏囊chTLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的TRIF依賴型途徑，促進(jìn)TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達(dá)；劉海云[15]研究了chTLR4在APS致雞急性呼吸道損傷中的作用，結(jié)果表明APS可通過chTLR4的TRIF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活下游細(xì)胞因子合成分泌，從而調(diào)節(jié)雛雞腸道免疫功能。劉瑞[16]通過黃芪多糖影響雛雞免疫器官TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，發(fā)現(xiàn)APS可通過chTLR4的TRIF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達(dá)。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同劑量中藥復(fù)方多糖均能顯著提高TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達(dá)量，證明中藥復(fù)方多糖能被雞淋巴細(xì)胞TLR4受體識(shí)別，可通過TLR4受體激活TRIF依賴性信號(hào)途徑，此研究結(jié)果與Ruili、劉海云、劉瑞等的研究結(jié)果一致?？墒?，有研究將LPS作用于雞巨噬細(xì)胞系HD11，發(fā)現(xiàn) IL-1β mRNA、 IL-8 mRNA表達(dá)量顯著增加， IFN-βmRNA表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)差異，此結(jié)果可能說(shuō)明雞TLR4信號(hào)通路只通過MYD88依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。但是如果用[TLR3(Poly(IC)]刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) IFN-β mRNA表達(dá)量顯著升高，提示禽類存在TRIF信號(hào)通路[17]。Brownlie等[18]于2011年提出TRAM基因在雞的基因中是不存在的，而其他研究表明，TRAM蛋白在哺乳動(dòng)物TLR4信號(hào)通路的TRIF依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著連接TLR4和TRIF的作用。然而近期Karnati等[19]研究發(fā)現(xiàn)LPS處理Aseel、Ghagus品種雞的PBMCs后，TRIF基因表達(dá)量顯著上升，提示雞體內(nèi)TLR4信號(hào)通路可以通過MYD88依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和TRIF依賴轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑2種機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果與此結(jié)果有相似之處，提示在雞體內(nèi)，TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TRIF依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能與雞的品種有關(guān)，并且與哺乳動(dòng)物可能是有差異的，但是其機(jī)制目前還不清楚，需進(jìn)一步研究。

另外，通過比較發(fā)現(xiàn)，cCHMPS與雞細(xì)胞上TLR4受體結(jié)合，促進(jìn)雞TRIF表達(dá)量上調(diào)，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，雞 TRIF表達(dá)量降低，這可能受機(jī)體的反饋機(jī)制的調(diào)節(jié)，使雞TRIFmRNA的表達(dá)量持續(xù)在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的水平， IRF3和 IFN-β mRNA的表達(dá)量也不是持續(xù)升高，都是有一定的限制，即存在動(dòng)態(tài)平衡。而在哺乳動(dòng)物TLR4信號(hào)通路研究中發(fā)現(xiàn)了負(fù)調(diào)控分子，比如說(shuō)細(xì)胞內(nèi)的sMYD88、SOCSI和細(xì)胞膜上的sTLR4、sT2等[20]。雞TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達(dá)量先升高后降低再升高，另一個(gè)原因可能是cCHMPS與細(xì)胞上TLR3受體結(jié)合，經(jīng)過其他通路共同作用于TRIF，導(dǎo)致 IRF3、 IFN-β mRNA的表達(dá)量出現(xiàn)此類變化。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，雞淋巴細(xì)胞內(nèi)可能存在類似的負(fù)調(diào)控因子，使信號(hào)通路的激活和抑制保持平衡，因?yàn)檫^度的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)系統(tǒng)的紊亂。

3.2 雞 MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性對(duì)cCHMPS促進(jìn)TLR4介導(dǎo)的TRIF依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件的影響

雞 MHC B-LβⅡ基因具有豐富的多態(tài)性和功能特異性，最近幾年成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。李福偉等[4]研究表明個(gè)體以及品種之間存在不同免疫能力的遺傳差異，并且不同的免疫性狀存在顯著的優(yōu)勢(shì)基因型。李尚民[21]研究表明雞 MHC B-LβⅡ基因外顯子2的遺傳變異對(duì)京海黃雞抗病能力影響顯著，可作為球蟲抗病能力選育候選基因。劉立波[22]研究雞MHCB-L基因SNPs單倍體型與血清中IgG含量、LPS含量、禽流感(AI)抗體滴度等免疫性狀關(guān)系，結(jié)果表明不同免疫性狀存在顯著相關(guān)的優(yōu)勢(shì)SNPs單倍型。朱曉慶[23]研究發(fā)現(xiàn)， MHC B-LβⅡ基因Hin1I位點(diǎn)多態(tài)性會(huì)影響一定純度中藥復(fù)方多糖的免疫調(diào)節(jié)劑量的篩選，不同 MHC B-LβⅡ基因型雞中一定純度中藥復(fù)方多糖的最適免疫調(diào)節(jié)劑量不同。郭曉[24]通過一定純度中藥復(fù)方多糖對(duì)不同 MHC B-LβⅡ 基因型雞免疫調(diào)節(jié)作用受體 TLR2、TLR4 及免疫信號(hào)分子的研究，結(jié)果顯示不同基因型組的最適中藥復(fù)方多糖的免疫劑量有所不同。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)cCHMPS劑量相同時(shí)，不同 MHC B-LβⅡ 基因型雞淋巴細(xì)胞中TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達(dá)量差異顯著，且同一基因型不同劑量時(shí)，TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表達(dá)量也有差異。出現(xiàn)不同劑量cCHMPS對(duì)調(diào)節(jié)雞淋巴細(xì)胞TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)TRIF依賴性途徑主要元件最適基因型不同的原因可能是：MHC classⅡ 類分子對(duì)中藥多糖的感知存在數(shù)量與濃度上敏感性的差異，過高或過低劑量的中藥多糖均不會(huì)產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，從而引起細(xì)胞因子含量的差異。對(duì)于BB 基因型雞而言，高劑量cCHMPS較適宜，可有效刺激淋巴細(xì)胞TLR4信號(hào)通路的激活；對(duì)于 AA和 BC 基因型而言，低劑量cCHMPS較適宜，而高劑量cCHMPS對(duì)淋巴細(xì)胞可能產(chǎn)生一定程度的免疫抑制。

4 結(jié) 論

本研究表明， MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性使不同個(gè)體雞淋巴細(xì)胞的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游TRIF依賴性途徑主要元件mRNA的表達(dá)產(chǎn)生差異，并且對(duì)促進(jìn)其信號(hào)通路主要元件mRNA的表達(dá)的最適cCHMPS劑量有一定的影響，同時(shí)中藥復(fù)方多糖可激活雞淋巴細(xì)胞中TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TRIF依賴性途徑，調(diào)控雞細(xì)胞免疫，進(jìn)一步從雞體外淋巴細(xì)胞上受體模式及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度闡明中藥復(fù)方多糖調(diào)節(jié)雞細(xì)胞免疫功能的分子機(jī)制。