楊 茜 王 靜 裴雙義

(唐山市工人醫(yī)院導(dǎo)管室,唐山063000)

抑郁癥是一種心身疾病,以焦慮、睡眠障礙、食欲變化和缺乏快感為特征,發(fā)病率高，治療效果差，嚴重危害人類健康。抑郁癥發(fā)病原因復(fù)雜，海馬神經(jīng)元細胞的凋亡或壞死、神經(jīng)細胞突觸的可塑性受到損害是其可能機制[1]。海馬是非常重要的腦區(qū)，在認知能力、學(xué)習(xí)記憶能力、情感、行為等諸多方面發(fā)揮不可替代的作用。多項研究表明，抑郁癥能夠?qū)е禄颊吆ｑR體積變小，海馬神經(jīng)元數(shù)量變少、樹突結(jié)構(gòu)重建受阻、海馬萎縮，而抗抑郁藥物能夠較好地緩解這一過程[2]。

磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase/serine/threonine kinase,PI3K/AKT)P13K/Akt通路在細胞生長、糖代謝、增殖、核糖體功能、轉(zhuǎn)錄和凋亡等方面起著關(guān)鍵的作用。P13K是一種重要的蛋白激酶，P13K活化后，可進一步磷酸化激活A(yù)kt，并調(diào)控下游的雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)、半胱天冬酶(Caspase)、B細胞淋巴瘤基因-2/及其相關(guān)X蛋白(B cell lymphoma-2/Bcl-2 Associated X protein,Bcl-2/BAX)等多條信號通路的活性，該信號通路被公認為具有很強的促進細胞生長和抗凋亡能力,影響細胞增殖、凋亡及其他生物學(xué)行為[3]。

Venlafaxine(文拉法辛)是一種新型的抗抑郁藥，作用于5-羥色胺和去甲腎上腺素,有效地抑制再攝取,同時抑制多巴胺的再攝取,進而改善抑郁患者臨床癥狀。本研究以抑郁模型大鼠為研究對象，觀察文拉法辛對其行為學(xué)、認知功能、海馬神經(jīng)元的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和凋亡與凋亡蛋白的關(guān)系及對PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的影響，進一步研究文拉法辛抗抑郁的機理，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與材料 雄性SD大鼠100只，SPF級，體重180～200 g，北京維通利華公司采購，恒溫23℃，晝夜節(jié)律光照，自由隨意進食。 Venlafaxine(文拉法辛)購自惠氏制藥有限公司。從美國羅氏公司購得TUNEL凋亡試劑盒。尼氏染色試劑盒購自北京雷根生物科技有限公司。PI3K、pAKt、BCL-2、BAX、mTOR、Caspase-3蛋白一抗購自英國Abcam公司。二抗購自中杉金橋有限公司。

1.1.2實驗儀器 自制強迫游泳儀。曠場測驗箱購自美國Med公司。-80℃冰箱購自美國SANYO公司。光學(xué)顯微鏡從日本索尼公司購買。Western blot系統(tǒng)是從美國Bio-Rad公司購買。Morris水迷宮設(shè)備，購自上海鑫軟科技公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型建立 100只SD雄性大鼠，喂養(yǎng)7 d適應(yīng)環(huán)境后，采取曠場實驗評估，標準水平活動得分40～100分。將符合條件的大鼠隨機分為5組,對照組，模型組和文拉法辛1、2、3組。對照組正常喂養(yǎng)，除行為學(xué)測驗外無其他刺激。模型組及文拉法辛1、2、3組采用慢性無法預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)刺激聯(lián)合孤養(yǎng)方式，喂養(yǎng)21 d，建立抑郁模型[4-6]。CUMS包括8種不同刺激，4℃冰水中游泳，停止供水24 h，停止供食24 h，連續(xù)夾尾 1 min，捆綁束縛2 min，懸掛5 min，晝夜逆轉(zhuǎn)24 h，45℃水溫游泳5 min。每天一種刺激，連續(xù)3 d，刺激不重復(fù)。造模完成后進行曠場實驗及糖水消耗實驗評估造模是否成功[4-6]。建模成功后，文拉法辛1、2、3組分別腹腔注射文拉法辛5、15、45 mg/(kg·d)，模型組注射鹽水，連續(xù)14 d。

1.2.2行為學(xué)測定

1.2.2.1曠場實驗 在刺激前、造模后及給藥14 d后，采用ENV-520曠場測驗儀跟蹤大鼠的活動，對自發(fā)活動和探索能力進行檢測,分析時間3 min,活動總路程記錄。

1.2.2.2糖水消耗試驗 實驗前大鼠已行糖水適應(yīng)訓(xùn)練。在應(yīng)激刺激前、造模完成后及給藥結(jié)束后均進行糖水消耗試驗。停止供水12 h后，各組大鼠按只分別給予1瓶1%蔗糖溶液和1瓶純水，在1 h的自由隨意飲用后,蔗糖水和純水進行稱重，衡量糖水消耗和糖水偏好指數(shù)=蔗糖水消耗/總液體消耗×100%。

1.2.2.3強迫游泳實驗 大鼠放置于大水桶中，高50 cm直徑30 cm，水深30 cm， 25℃水溫，預(yù)強迫游泳15 min，恢復(fù)24 h，強迫游泳5 min，記錄各組大鼠靜止不動狀態(tài)的時間，即為浮在水面、停止掙扎或只存在肢體的微小活動確保頭部浮起的時間。

1.2.3水迷宮實驗 使用Morris水迷宮對大鼠認知功能進行評價。水迷宮為恒溫圓柱形水池，池水及池壁顏色均為黑色，分4象限，2象限下面隱蔽平臺距離水表面2 cm，固定位置。將大鼠隨機放入4個象限，分別進入水中，每組大鼠2 min的到達時間進行了記錄，這是逃避潛伏期。如果老鼠不能在2 min 找到隱藏平臺,大鼠放置在平臺15 s，記錄為潛伏期120 s。在第6天,平臺被移走，大鼠進入水中，從先前的4個象限進入水中。計時2 min，大鼠通過平臺象限的時間記錄為空間探索時間。

1.2.4尼氏染色 大鼠灌注固定取海馬，進行低溫冰凍切片，晾干后先用二甲苯進行脫脂，再放入逆行濃度梯度的酒精溶液中進行脫脂，在蒸餾水中浸泡2 min，室溫15 min甲苯胺藍溶液(濃度為1%)染色，然后在蒸餾水中浸泡2 min， 95%乙醇分色，放入依次增加的酒精溶液中進行脫水，用二甲苯溶液進行切片透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察海馬細胞形態(tài)變化。

1.2.5TUNEL染色 海馬組織切片后先進行脫蠟，再采用乙醇進行脫水，使用蛋白酶K進行消化，PBS溶液洗滌2次，滴入TUNEL反應(yīng)液及復(fù)合液，采用DAB染色，最后再經(jīng)蘇木素染色，封片后觀察。隨機選取海馬CA3區(qū)的組織切片3張，隨機抽取5個視野，染色呈現(xiàn)為棕褐色的細胞為凋亡陽性細胞，在每個視野范圍內(nèi)均檢測到棕色陽性細胞，計算數(shù)目后除以細胞總數(shù)，平均值為細胞凋亡率。

1.2.6Western blot方法檢測 大鼠給藥完成后取材，分離海馬組織，放置于冰上，對組織進行研磨，加入蛋白裂解液，4℃離心30 min，蛋白質(zhì)定量試劑盒操作定量。取相同量的樣品,進行12%凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉過夜，封閉阻斷抗體，一抗稀釋溶液為0.5%BSA溶液，和印跡膜在室溫下孵育2 h，取出用TBST洗膜10 min重復(fù)3次，二抗稀釋溶液為0.5%BSA溶液，印跡膜在室溫下孵育2 h后洗滌液TBST 15 min 重復(fù)3次，加入ECL試劑，凝膠成像儀觀測和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1文拉法辛對抑郁模型大鼠自發(fā)活動的影響 曠場實驗測得對照組、模型組、文拉法辛1、2、3組大鼠刺激前自發(fā)活動總路程比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后抑郁模型組及文拉法辛1、2、3組自發(fā)活動量明顯低于對照組(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義，抑郁模型成功建立。造模后抑郁模型組及文拉法辛1、2、3組活動總路程比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥14 d后對照組與模型組自發(fā)活動路程與給藥前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。文拉法辛1、2、3組給藥14 d后自發(fā)活動較模型組及給藥前顯著增加，且隨著濃度升高而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2文拉法辛對抑郁模型大鼠糖水消耗試驗的影響 正常對照組，抑郁模型組和文拉法辛1、2、3組

刺激前糖水消耗試驗和糖水偏好指數(shù)三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模成功后，抑郁模型組及文拉法辛1、2、3組活動糖水消耗和糖水偏好指數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義，考慮抑郁模型建模成功。造模后抑郁模型組及文拉法辛組糖水消耗量和糖水偏好指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥14 d后，對照組和模型組糖水消耗量和糖水偏好指數(shù)與用藥前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥14 d后文拉法辛1、2、3組糖水消耗和糖水偏愛指數(shù)較給藥前及模型組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著濃度升高而增加。見表2。

2.3文拉法辛對抑郁模型大鼠強迫游泳不動時間影響 給藥結(jié)束后正常對照組、抑郁模型組、文拉法辛組大鼠強迫游泳不動時間分別為(89.1±10.2)s、(138.7±16.6)s和(92.6±10.5)s。對照組強迫游泳不動時間最短，抑郁模型組強迫游泳不動時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較文拉法辛組強迫游泳不動時間縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，文拉法辛組與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

2.4文拉法辛對抑郁模型大鼠水迷宮實驗結(jié)果比較 給藥結(jié)束后正常對照組、抑郁模型組、文拉法辛1、2、3組逃避潛伏期分別為(8.7±2.8)s、(21.8±5.0)s、(11.9±2.6)s、(10.8±2.5)s和(10.4±2.7)s，空間探索時間分別為(9.7±3.4)s、(20.6±3.4)s、(12.4±3.9)s、(11.8±3.6)s和(11.4±2.9)s。

表1文拉法辛對抑郁模型大鼠自發(fā)活動的影響

Tab.1EffectofVenlafaxineonspontaneousactivityindepressionmodelrats

Note:Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05.

表2文拉法辛對抑郁模型大鼠糖水消耗試驗的影響

Tab.2EffectsofVenlafaxineonsugarwaterconsumptiontestindepressionmodelrats

Note:Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05.

大鼠對照組逃避潛伏期和空間探索時間最短，模型組和文拉法辛1、2、3組逃避潛伏期和空間探索時間均長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。文拉法辛1、2、3組逃避潛伏期和空間探索時間隨著濃度升高而減少，均短于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.5文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響 正常對照組大鼠海馬CA3神經(jīng)元細胞層次豐富，排列整齊，包膜完整，形態(tài)正常，未見細胞壞死。抑郁模型組大鼠海馬神經(jīng)元層次變少，細胞萎縮、排列稀疏，胞核變小甚至固縮，壞死細胞多見。文拉法辛1、2、3組海馬神經(jīng)元細胞層次豐富，細胞形態(tài)規(guī)則，壞死細胞較少，較抑郁模型組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)改善顯著。見圖1。

表3各組大鼠給藥后強迫游泳及水迷宮實驗結(jié)果比較

Tab.3Comparisonofexperimentalresultsofforcedswimmingandwatermazebyratsineachgroup

Groupsmotionless-time ofswimming by force(s)Escapelatency(s)Spaceexploration time(s)Control89.1±10.28.7±2.89.7±3.4Model138.7±16.61)21.8±5.01)20.6±3.41)Ven 192.6±10.51)2)11.9±2.61)2)12.4±3.91)2)Ven 292.2±11.61)2)10.8±2.51)2)11.8±3.61)2)Ven 391.9±10.71)2)10.4±2.71)2)11.4±2.91)2)

Note:Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

圖1 文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬CA3區(qū)尼氏染色(×200)的影響Fig.1 Effect of Venlafaxine on hippocampal CA3 region of depression model rat with Nissl straining(×200)Note: A.Control group；B.Model group；C.Venlafaxine group 1；D.Venlafaxine group 2；E.Venlafaxine group 3.

2.6文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響 TUNEL色中棕褐色即為凋亡陽性細胞。正常對照組凋亡細胞數(shù)量少見，凋亡率(8.9±1.1)%；抑郁模型組凋亡細胞顯著增加(53.5±3.7)%，與正常對照組相比差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；文拉法辛1、2、3組凋亡率分別為(18.6±2.4)%、(16.3±1.7)%和(13.2±1.9)%，隨著文拉法辛濃度增加而降低，與模型組比較，凋亡細胞出現(xiàn)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、3。

圖2 文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬CA3區(qū)TUNEL染色(×200)的影響Fig.2 Effect of Venlafaxine on hippocampal CA3 region of depression model rat with TUNEL straining(×200)Note: A.Control group；B.Model group；C.Venlafaxine group 1；D.Venlafaxine group 2；E.Venlafaxine group 3.

圖3 文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元TUNEL凋亡率的影響Fig.3 Effects of Venlafaxine on apoptosis rate of hippoca-mpal neurons of depression model ratsNote: Compared with the control group,**.P<0.01；compared with the model group,##.P<0.01.

圖4 文拉法辛對抑郁模型大鼠各蛋白水平的影響Fig.4 Effects of Venlafaxine on levels of protein in depression model rats

2.7文拉法辛對抑郁模型大鼠海馬PI3K、pAKt、mTOR、BCL-2、BAX、Caspase-3蛋白表達的影響 模型組、文拉法辛1、2、3組與正常組比較，PI3K、pAKt、mTOR、bcl-2的表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，bax和Caspase-3的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。文拉法辛1、2、3與模型組比較，PI3K、pAKt、mTOR、bcl-2的表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，bax和Caspase-3的表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且文拉法辛1、2、3組各蛋白的表達均具有濃度依賴性。見圖4。

3 討論

在我們這項研究中，慢性無法預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)孤養(yǎng)21 d被用來建立大鼠抑郁模型，模型大鼠的自發(fā)活動較前降低(P<0.05)，大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、活動減少、不喜飲食、糖水偏好指數(shù)和糖水消耗量明顯下降(P<0.05)，提示本研究抑郁模型大鼠造模成功，與其他文獻報道一致[4-6]。文拉法辛能夠抑制腦細胞中去甲腎上腺素、5-羥色胺和多巴胺的再攝取，可以有效改善抑郁癥狀，是一種廣泛使用的臨床抗抑郁藥[6-8]。給予文拉法辛處理抑郁模型大鼠后，與抑郁模型組比較，大鼠自發(fā)活動，糖水偏好指數(shù)及糖水消耗量顯著增加，強迫游泳不動時間縮短，提示文拉法辛能夠改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，與其他研究報道結(jié)果一致[6,8-11]。

多項研究證實，抑郁患者常常伴有海馬形態(tài)的萎縮和認知功能的受損[12,13]。水迷宮能夠檢測大鼠認知功能，本研究通過水迷宮實驗，發(fā)現(xiàn)抑郁模型大鼠逃避潛伏期和空間探索時間較正常對照組明顯延長，說明抑郁模型大鼠導(dǎo)致大鼠認知、學(xué)習(xí)記憶能力的損害。文拉法辛處理后，逃避潛伏期和空間探索時間較模型組明顯縮短，說明文拉法辛能夠改善抑郁模型大鼠的認知功能。

慢性抑郁患者頭顱MRI提示患者大腦區(qū)域較正常人縮小，海馬萎縮嚴重，神經(jīng)元數(shù)量變少，尤其以海馬齒狀回和CA3區(qū)的神經(jīng)元細胞損害最為嚴重[14-16]。慢性應(yīng)激狀態(tài)建立抑郁模型大鼠，能夠引起大鼠海馬功能結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的凋亡，出現(xiàn)大腦功能的損害，海馬CA3區(qū)是損傷的典型部位，其損傷程度與抑郁行為保持一致[16,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元萎縮及壞死較為嚴重，且海馬神經(jīng)元凋亡率較正常對照組顯著增加，文拉法辛藥物處理后海馬神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則細胞完整，萎縮及壞死細胞較少，形態(tài)結(jié)構(gòu)較模型組改善顯著，且海馬神經(jīng)元凋亡率較模型組顯著下降，提示文拉法辛能夠減少海馬神經(jīng)元的凋亡率，對海馬神經(jīng)元細胞有保護作用。

PI3K/Akt信號通路中活化的P13K激活A(yù)kt，信號進一步轉(zhuǎn)導(dǎo)，Akt激酶能調(diào)控下游的mTOR、Caspase、BAX/Bcl-2等多條信號通路的活性，引起級聯(lián)反應(yīng)，參與細胞的生理代謝過程[18]。BAX和BCL-2是常見的促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白， caspase-3是細胞凋亡級聯(lián)的關(guān)鍵酶,是細胞凋亡級聯(lián)的核心,Caspase-3酶的水解活性超細蛋白作用可直接誘導(dǎo)細胞凋亡，并能損傷DNA加速凋亡[3,18-20]。研究顯示，抗抑郁藥能夠影響PI3K/Akt信號通路[3,17,18]。本研究顯示，抑郁模型組與正常組比較，PI3K、pAKt、mTOR、BCL-2表達明顯下降，BAX、Caspase-3表達明顯增加，文拉法辛處理后與抑郁模型組相比能夠顯著提高PI3K、pAKt、mTOR、BCL-2的表達(P<0.05)，顯著降低BAX、Caspase-3表達，提示文拉法辛能夠通過PI3K/Akt信號通路抑制海馬神經(jīng)元細胞的凋亡。

綜上所述，文拉法辛能夠改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為和認知功能，并且能夠通過PI3K/Akt信號通路改善抑郁模型大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡。