王春陽(yáng) 嚴(yán)琴琴 魏蘭蘭 賀茂芳 鄭夢(mèng)迪

(西安醫(yī)學(xué)院，西安710021)

腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，單股正鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒手足口病的主要病原體之一，其感染可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，大部分重癥手足口病例是由EV71感染所致[1]。大部分EV71感染的患兒主要表現(xiàn)為手、足、口皮疹、皰疹，個(gè)別重癥病例可以出現(xiàn)腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、神經(jīng)源性肺水腫、肺出血等并發(fā)癥。目前臨床上針對(duì)EV71感染的治療主要為對(duì)癥治療和支持治療。臨床上尚沒(méi)有有效的抗病毒藥物以及上市的疫苗。

三白草是三白草科植物三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill的全草，具有清熱解毒，利尿消腫的功效。民間用于白帶、尿路感染、腎炎水腫、外治瘡瘍腫毒及濕疹等疾病的治療[2]。三白草的主要成分包括槲皮素、槲皮甙、異槲皮甙、金絲桃甙及蕓香甙[3]。三白草及其活性成分被報(bào)道能夠抑制NF-κB的活性進(jìn)而抑制炎癥因子的產(chǎn)生[4]。又有研究發(fā)現(xiàn)，三白草的主要成分槲皮素、槲皮苷等能夠通過(guò)阻斷NF-κB信號(hào)通路抑制皰疹病毒的感染[5，6]。然而關(guān)于三白草抗EV71病毒活性的研究尚少。EV71病毒引起的手足口病的嚴(yán)重程度與炎癥因子的產(chǎn)生密切相關(guān)，而NF-κB信號(hào)通路在炎癥因子的產(chǎn)生過(guò)程中起到了不可忽視的作用，因此本研究探討了三白草水提物是否能夠抑制EV71病毒活性以及NF-κB在此過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物 三白草藥材購(gòu)于陜西省西安市醫(yī)府大藥房，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室鄭夢(mèng)迪教師鑒定。三白草水提物的制備：將烘干的三白草藥材粉碎后，稱(chēng)取10.0 g，加入100 ml蒸餾水，于60℃水浴鍋中孵育24 h。棄去藥渣，5 000 r/min離心10 min。取上清液，濃縮至20 ml，轉(zhuǎn)至減壓干燥機(jī)完全干燥，用含5% DMSO的細(xì)胞維持液配成10 mg/ml母液，存于EP管中，放于-20℃冰箱備用。利巴韋林注射液(廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號(hào)：120201)。

1.1.2細(xì)胞和病毒 非洲綠猴腎上皮Vero細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。細(xì)胞培養(yǎng)于包含高糖的熱滅活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、以及非必需氨基酸的完全DMEM中。 細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。EV71病毒(阜陽(yáng)株)由江蘇省疾病預(yù)防與控制中心惠贈(zèng)。本單位實(shí)驗(yàn)室擁有完備的生物安全P2 級(jí)實(shí)驗(yàn)室供細(xì)胞培養(yǎng)。EV71在RD細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后分裝保存于-80℃冰箱。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞分組及干預(yù)方法 本實(shí)驗(yàn)分5組，包括空白對(duì)照組(Control)、不同濃度三白草水提液處理組、僅有EV71感染組(EV71)、不同濃度三白草水提液處理組(不同濃度三白草水提液+EV71)、利巴韋林處理組(0.31 mg/ml利巴韋林+EV71)。其中空白對(duì)照組(Control)、不同濃度三白草水提液處理組用于三白草水提物的細(xì)胞毒性檢測(cè)?？瞻讓?duì)照組(Control)、僅有EV71感染組(EV71)、不同濃度三白草水提液處理組(不同濃度三白草水提液+EV71)和利巴韋林處理組(0.31 mg/ml利巴韋林+EV71)用于三白草水提物抗EV71活性檢測(cè)?？瞻讓?duì)照組(Control)、僅有EV71感染組(EV71)和三白草水提液處理組(三白草水提液+EV71)供三白草水提物抑制炎癥因子的產(chǎn)生的檢測(cè)用?？瞻讓?duì)照組(Control)、僅有EV71感染組(EV71)和不同濃度三白草水提液處理組(不同濃度三白草水提液+EV71)用于三白草水提物能夠抑制EV71誘導(dǎo)的NF-κB的活化的檢測(cè)。

1.2.2提取核蛋白及Western blot檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)于生長(zhǎng)良好的單層Vero細(xì)胞中加入不同濃度的三白草水提液(終濃度為0.015、0.03、0.1 mg/ml)孵育2 h，EV71以MOI為0.1感染Vero細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞核蛋白。設(shè)置空白對(duì)照和感染組對(duì)照。根據(jù)核質(zhì)抽提試劑盒(P0027，碧云天，江蘇，中國(guó))的說(shuō)明書(shū)先配好相關(guān)試劑，放于冰上備用。用PBS將細(xì)胞清洗3遍，然后用EDTA溶液處理細(xì)胞，離心收集細(xì)胞至新的EP管中，盡量吸盡上清，留下沉淀。然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核質(zhì)蛋白抽提。將抽提的蛋白放于-70℃冰箱凍存。核蛋白用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，用于后續(xù)的電泳實(shí)驗(yàn)。電泳完之后將細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的小牛血清(BSA)室溫封閉1 h，然后將膜與1∶1 000稀釋的一抗封閉液(anti-p65抗體貨號(hào)：#8242，Cell Signaling公司；anti-actin抗體貨號(hào)：#4970，Cell Signaling公司)一起孵育，4℃靜置過(guò)夜。用TBST漂洗膜3次，每次10 min。再將膜與含1∶10 000稀釋的二抗(sc2357CM，Santa Cruz公司)封閉液一起室溫孵育2 h。TBST漂洗膜3次，每次10 min。然后將膜放于凝膠成像儀中拍照。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime-PCR)測(cè)定IL-6、IL-8以及IL-1β的表達(dá) 根據(jù)RNA提取試劑盒(Qiagen，Germany)說(shuō)明書(shū)提取感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞的總RNA。用美國(guó)Thermo公司的Nanodrop測(cè)定RNA的濃度與純度。按照TaKaRa公司的2 Step Real Time RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RRO36A)說(shuō)明書(shū)，取500 ng RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后用獲得的cDNA作為模版按照TaKaRa的SYBR熒光定量Real-time PCR試劑盒(RR420A)的說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)液，然后在Applied Biosystems StepOnePlusTM儀器上進(jìn)行熒光定量反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件是：95℃預(yù)變性30 s，然后95℃ 5 s 60℃ 30 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因選取磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因。每個(gè)做3個(gè)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?；虻谋磉_(dá)水平按照公式2(ΔCt of Gene-ΔCt of GAPDH)進(jìn)行計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4三白草水提物的細(xì)胞毒性檢測(cè) 選擇生長(zhǎng)旺盛的單層RD細(xì)胞，用胰酶消化離心后加入DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。用移液器將細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔100 μl。用含2%血清的DMEM將各中藥提取物稀釋2倍比稀釋成10個(gè)濃度，分別加入單層RD細(xì)胞中，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照、病毒對(duì)照。于37℃、5%CO2孵箱中孵育。每日將培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)觀察72 h。用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力[7]。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔。讀取A570，細(xì)胞存活率=A570藥物/A570對(duì)照×100%。

1.2.5三白草水提物抗EV71活性檢測(cè) EV71引起的細(xì)胞病變效應(yīng)可以通過(guò)MTT的方法定量檢測(cè)。將不同濃度三白草水提液提前2 h加入生長(zhǎng)旺盛的單層Vero細(xì)胞培養(yǎng)液中，然后EV71以MOI為0.1感染Vero細(xì)胞24 h。一方面用MTT測(cè)定細(xì)胞活力，讀取A570值，利巴韋林為陽(yáng)性對(duì)照。按公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照的存活率；另一方面收集上清液，用TCID50的方法測(cè)定病毒滴度，以確定三白草水提液對(duì)EV71子代病毒釋放的影響。

1.2.6病毒滴度的測(cè)定 將消化懸浮的Vero細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)12～16 h。取10個(gè)EP管，每管各加入90 μl的無(wú)血清DMEM。將病毒原液吹打均勻后吸取10 μl加入到第一管中，用槍頭上下吹打混勻，從第一管中吸取10 μl加入第二管，上下吹打混勻，以此類(lèi)推逐個(gè)稀釋至10-8，每一次稀釋都要更換槍頭。然后將各稀釋度的病毒加入到已培養(yǎng)好的Vero細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，每個(gè)孔10 μl。觀察并記錄細(xì)胞病變情況。按照Reed-Muench方法[8]，計(jì)算TCID50。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1引物序列

Tab.1Primerssequence

Gene namesForward primerReverse primerβ-actinATGGATGACGATATCGCTGATGAGGTAGTCTGTCAGGTIL-1βGGACAAGCTGAGGAAGATGCTCGTTATCCCATGTGTCGAAIL-6AAAGAGGCACTGGCAGAAAATTTCACCAGGCAAGTCTCCTIL-8GTTCCACTGTGCCTTGGTTTGCTTCCACATGTCCTCACAA

2 結(jié)果

2.1三白草水提物的細(xì)胞毒性檢測(cè) MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三白草水提物在0.1 mg/ml的濃度下細(xì)胞活力與對(duì)照組相差無(wú)幾(圖1)，說(shuō)明三白草水提物在此濃度以內(nèi)對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的毒性和抑制作用。

2.2三白草水提液抗EV71作用 分別用不同濃度的三白草水提液預(yù)處理Vero細(xì)胞2 h，然后EV71以MOI為0.1感染細(xì)胞24 h，利巴韋林作為陽(yáng)性對(duì)照。應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，三白草水提物在0.1、0.03、0.015 mg/ml的濃度下的細(xì)胞活力結(jié)果表明，與對(duì)照相比，三白草水提物在0.1、0.03、0.015 mg/ml的濃度下能夠顯著提高細(xì)胞的存活率(P值分別為0.031 1、0.001 6、0.001 8)表明其能夠顯著抑制EV71感染誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并且這種抑制作用具有劑量依賴性(圖2A)。陽(yáng)性對(duì)照利巴韋林也能夠顯著抑制EV71誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(P值為0.000 6)。收集細(xì)胞上清液，檢測(cè)病毒滴度發(fā)現(xiàn)(圖2B)，與病毒組相比，三白草水提液在0.1、0.03以及0.015 mg/ml的濃度下分別將病毒滴度降低了1.60 logs、1.85 logs和3.45 logs(P值分別為0.020 5、0.050 9、0.003 9)，利巴韋林將病毒滴度降低了3.54 logs(P值為0.003 8)。以上結(jié)果說(shuō)明三白草水提物能夠抑制EV71子代病毒釋放的影響，并且在0.1 mg/ml的濃度下，具有與陽(yáng)性對(duì)照利巴韋林相當(dāng)?shù)目共《咀饔谩?/p>

2.3三白草水提物抑制炎癥因子的產(chǎn)生 病毒感染能夠誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道，EV71感染能夠誘導(dǎo)大量炎癥因子的產(chǎn)生，比如IL-1β、IL-6以及IL-8[9]。這些炎癥因子與疾病的嚴(yán)重程度明顯相關(guān)[10-12]。提前用0.1 mg/ml的三白草水提物處理細(xì)胞2 h，EV71感染Vero細(xì)胞24 h后提取RNA，應(yīng)用Realtime PCR的方法檢測(cè)IL-1β、IL-6以及IL-8的mRNA的表達(dá)。

圖1 三白草水提物的細(xì)胞毒性檢測(cè)Fig.1 Determination of cytotoxicity of water extracts of Saururus chinensis(Lour.)Baill on Vero cells

圖2 三白草水提液抑制EV71感染Fig.2 Inhibition of EV71 infection by water extracts of Saururus chinensis(Lour.)BaillNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

圖3 三白草水提物抑制炎癥因子的產(chǎn)生Fig.3 Water extracts of Saururus chinensis(Lour.)Baill inhibited expression of cytokines induced by EV71 infectionNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

圖4 三白草水提物能夠抑制EV71誘導(dǎo)的NF-κB的活化Fig.4 Water extracts of Saururus chinensis(Lour.)Baill blocked nuclear translocation of p-65/NF-κB during EV71 infectionNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

結(jié)果表明，三白草水提液能夠明顯降低EV71誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6以及IL-8的mRNA的表達(dá)(P值分別為0.005 5，0.010 1，0.056 8)，說(shuō)明三白草能夠抑制炎癥因子的產(chǎn)生(圖3)。

2.4三白草水提物能夠抑制EV71誘導(dǎo)的NF-κB的活化 EV71感染能夠誘導(dǎo)NF-κB的活化，并且NF-κB信號(hào)通路在炎癥因子的產(chǎn)生過(guò)程中起著重要作用。NF-κB的活化與否可以通過(guò)檢測(cè)p-65的核轉(zhuǎn)位情況。為此，我們檢測(cè)了三白草水提物是否對(duì)p65的入核過(guò)程有影響。EV71感染24 h后明顯誘導(dǎo)了p-65的核轉(zhuǎn)位(圖4)。通過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算NF-κB進(jìn)核相對(duì)于對(duì)照的比值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三白草水提物0.015、0.03、0.1 mg/ml以及EV71的NF-κB進(jìn)核的相對(duì)比值分別為1.323、2.267、2.218、3.699，提示三白草水提物在0.015、0.03、0.1 mg/ml的濃度下能夠明顯降低EV71誘導(dǎo)的p-65的核轉(zhuǎn)移(P值分別為0.002 7、0.014 6、0.042 2)。以上結(jié)果說(shuō)明三白草水提物預(yù)處理細(xì)胞能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。

3 討論

EV71目前被認(rèn)為是繼脊髓灰質(zhì)炎病毒后又一個(gè)最重要的噬神經(jīng)性腸道病毒，因而引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。EV71感染的治療目前主要是對(duì)癥治療和支持治療。2011年的手足口病診療指南上推薦的利巴韋林雖然有一定療效，但是因毒副作用大，患者長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致多個(gè)系統(tǒng)并發(fā)癥，尤其是血液系統(tǒng)，例如貧血，從而造成機(jī)體損傷[13]。鑒于EV71感染尚無(wú)有效的抗病毒藥物和上市的疫苗，尋找安全有效的中藥抗病毒成分就顯得格外迫切。

三白草屬于三白草科植物，三白草科植物有抗炎、清熱、解毒的功能，民間主要用于治療火淋，黃疸、濕疹等。通?？寡浊鍩峤舛绢?lèi)中草藥可以通過(guò)影響病毒的復(fù)制和代謝過(guò)程起到直接殺死病毒或者抑制病毒生長(zhǎng)的作用，目前關(guān)于其抗病毒作用報(bào)道較少。僅有學(xué)者報(bào)道三白草水提物可以抑制HSV-2 病毒復(fù)制，其機(jī)制與抑制病毒復(fù)制所需的NF-κB 通路活化有關(guān)[14]。EV71屬于微小病毒科，腸道病毒屬?，F(xiàn)如今尚缺乏關(guān)于三白草抗EV71或其他腸道病毒活性的相關(guān)報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，三白草科植物的另一個(gè)植物魚(yú)腥草，能夠顯著抑制EV71的感染和炎癥因子的產(chǎn)生[8]。本研究通過(guò)EV71體外感染模型，發(fā)現(xiàn)三白草科植物三白草水提物也能夠明顯抑制EV71病毒的復(fù)制。魚(yú)腥草和三白草同屬三白草科，二者都具有抗炎的作用，而EV71感染的手足口患兒疾病的嚴(yán)重程度與炎癥因子的產(chǎn)生密切相關(guān)，因此這兩種植物可能都是通過(guò)發(fā)揮抗炎作用達(dá)到緩解EV71感染的作用。三白草水提液在0.1、0.03、0.015 mg/ml的濃度下能夠顯著抑制EV71感染誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和子代病毒的釋放，并且這種抑制作用具有劑量依賴性(圖2)。據(jù)報(bào)道，炎癥因子的產(chǎn)生，尤其是IL-6，在EV71的致病過(guò)程中起到重要作用，并且針對(duì)炎癥因子的靶向治療可以明顯減少神經(jīng)元的死亡及腦組織的炎性損傷[15]。NF-κB能夠被病毒感染所激活，并參與炎癥因子的產(chǎn)生。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，三白草水提液能夠明顯降低EV71感染誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)，并且能夠顯著抑制EV71對(duì)NF-κB的活化作用，進(jìn)而抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生。三白草的主要成分包括槲皮素、槲皮甙、異槲皮甙、金絲桃甙及蕓香甙[3]。據(jù)報(bào)道，三白草及其活性成分有抗炎和抗病毒的活性。究竟三白草中哪個(gè)活性成分起到了抗病毒的作用以及抗炎的作用仍需要進(jìn)一步的研究。三白草水提液在0.1 mg/ml的濃度下，具有與陽(yáng)性對(duì)照利巴韋林相當(dāng)?shù)目共《咀饔?。趙瑞玲等[13]學(xué)者通過(guò)對(duì)利巴韋林臨床應(yīng)用進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，利巴韋林應(yīng)用后不良反應(yīng)復(fù)雜多樣，累及多個(gè)系統(tǒng)，以血液系統(tǒng)最為常見(jiàn)。而三白草目前尚未見(jiàn)到相關(guān)不良反應(yīng)的報(bào)道，安全性較好。以上結(jié)果提示三白草水提液一方面能夠抑制EV71病毒的復(fù)制，一方面能夠阻斷NF-κB介導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生，從而為將來(lái)EV71感染的病毒研發(fā)，提供理論基礎(chǔ)。