王佳慧，艾竹君，馮蔚旭，何 丹，楊 芳，許建梅

（1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)院，海南?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)信息學(xué)院，海南?？?571199；3.海南醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代教育技術(shù)中心，海南?？?571199）

一些不法商人為了牟取利益，采取人為的方式將水泵入肉中，增加肉的質(zhì)量，生產(chǎn)注水肉。注水肉流入市場不僅會導(dǎo)致肉品市場秩序紊亂，還會因為水的注入改變?nèi)庠镜纳憝h(huán)境，容易引起病菌感染，危害人們的身體健康。隨著生活水平的提高，人們對肉品的質(zhì)量要求也變得更高。因此，有必要尋找一種快速、準(zhǔn)確檢測注水肉的方法，為人們采購生肉提供質(zhì)量保障。

目前有多種方法可以用于檢測注水肉，例如感官檢驗法、鏡檢法、熟食率法、試紙法和干燥法等。感官檢驗法雖可以快速檢測注水肉，但是由于個體感官的差異，每個人判斷的結(jié)果有可能不同，導(dǎo)致準(zhǔn)確性較差。試紙法雖簡單易行，但是靈敏度不高。干燥法雖準(zhǔn)確可靠，但耗時耗電，且破壞了樣本[1]。近年來，無損檢測注水肉的方法有生物電阻抗法、超聲波法和低場核磁共振法等[2-5]。其中生物電阻抗法雖然操作簡單、功能齊全，但阻抗值精度除受肉品組分影響，還與溫度、頻率、電極形狀等因素有關(guān)。超聲波法雖然快速準(zhǔn)確且能應(yīng)用于透明體系，但氣泡的存在會降低其他組分的超聲波信號，對測定產(chǎn)生干擾[6]。低場核磁共振技術(shù)具有非破壞性、小體積和快速檢測的優(yōu)點，成為近些年研究肉類的含水量和檢測注水肉的熱點之一。

豬里脊肉中水分占72.6%，蛋白質(zhì)占21.5%，脂肪占4.5%，水分所占比例最大。蓋圣美等人[7]利用低場核磁共振檢測分析注水豬肉中水分子的弛豫特性，分析了不同質(zhì)量（1，2，3，4，5 g） 下，不同注水比例（0，10%，20%，30%，40%，50%） 下肉樣品的橫向弛豫譜參數(shù)的變化。得出在樣品質(zhì)量為3 g時采樣，有利于獲得穩(wěn)定的試驗結(jié)果。但該研究要求注水比例偏大，對注水比例較小的肉樣品無法實現(xiàn)準(zhǔn)確檢測。Jianmei Xu等人[8]通過研究注水比例較低（0，2%，6%，10%，14%）肉樣品的橫向弛豫譜參數(shù)的規(guī)律性變化，建立了注水肉的識別模型，回代驗證和交叉驗證的正確率均為88%。試驗是在此基礎(chǔ)上通過增大樣本量來試探性地提高檢測的正確率，進(jìn)一步驗證建立的注水肉識別模型，為提高市場上對低注水比例注水肉的檢測能力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

材料：豬里脊肉，購于當(dāng)?shù)爻?，去除表面的脂肪和結(jié)締組織。

設(shè)備：MesoMR23-060H-I型核磁共振成像分析儀，蘇州紐邁分析儀器股份公司產(chǎn)品；JA1003型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司產(chǎn)品；H.SWX-420BS型電熱恒溫水溫箱，上海新苗醫(yī)療器械制造股份公司產(chǎn)品；100μL微量注射器，上海高鴿工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；手術(shù)刀。

1.2 原理

含氫質(zhì)子的樣品受射頻脈沖激勵發(fā)生核磁共振現(xiàn)象，隨后從激發(fā)態(tài)回到平衡態(tài)發(fā)生弛豫。對單組分的樣品，其在弛豫過程中產(chǎn)生的核磁共振信號按指數(shù)規(guī)律衰減。而肉是多組分樣品，其在弛豫過程中產(chǎn)生的信號按多重指數(shù)規(guī)律衰減，如公式（1）所示。

式中：Pi——樣品中第i種成分的信號強(qiáng)度；

T2i——第i種成分的橫向弛豫時間，其大小與氫質(zhì)子所處的微觀環(huán)境有關(guān)。

用CPMG序列測量不同時間的NMR信號，采用一定的算法計算出不同成分的Pi，得到樣品的橫向弛豫譜，該過程稱為反演。通過研究肉樣品的橫向弛豫譜與注水比例的關(guān)系，尋找檢測注水肉的方法。

1.3 樣品制備

試驗?zāi)M用注射器將水直接泵入肉中產(chǎn)生的注水肉。采集來自14頭豬的14塊里脊肉。將每塊里脊肉制成15份肉樣品，每份肉樣品的質(zhì)量為10+0.1 g，盡可能將肉樣品切成方形，3份肉樣品為1組，共5組。其中沒有注入水的一組作為正常肉樣品，另外4組作為注水肉樣品，分別注射2%，6%，10%和14%的純凈水，共制備210個樣品，將每個樣品單獨裝入小型自封袋中，將這些樣品放置在4℃冰箱中冷凍保存6 h。

1.4 NMR信號的測量

1.4.1 設(shè)置序列參數(shù)

使用低場核磁共振成像分析儀進(jìn)行NMR信號測量時，必須合理設(shè)置序列參數(shù)，才能保證測量的準(zhǔn)確性。為此，用質(zhì)量為10+0.1g的正常肉和注水比例為14%的2種肉樣品做預(yù)試驗，以確定正式試驗時所選用的序列參數(shù)值。試驗選用的射頻脈沖序列為CPMG序列。

（1） 設(shè)置重復(fù)采樣等待時間（TW）。在進(jìn)行多次重復(fù)測量時，為了保證每次測量的起點相同，必須在信號采集結(jié)束后，等待足夠長的時間再進(jìn)行下一次信號的采集和測量，以確保在等待時間內(nèi)樣品的縱向弛豫過程已經(jīng)基本完成。

（2） 設(shè)置射頻延時 （RFD）。MesoMR23-060HI型核磁共振成像分析儀的接收機(jī)開始接收信號的時間是固定的，過早施加90°射頻脈沖，開始接收的信號可能不是最大的信號。延遲發(fā)射90°射頻脈沖，可能在90°射頻脈沖發(fā)射前就已經(jīng)開始接收信號了，導(dǎo)致可能接收到射頻脈沖結(jié)束時產(chǎn)生的振蕩信號，影響測量的準(zhǔn)確性。因此，需要通過預(yù)試驗，設(shè)置合理的序列參數(shù)RFD，確定第1個測量點的位置是排除振蕩信號的最大信號。

（3） 設(shè)置前置放大增益 （PRG）、模擬增益（GR）1和數(shù)字增益 （DRG）

這3個增益的作用是確定放大采集的磁共振信號的倍數(shù)，提高信噪比。但信號放大的前提是不能出現(xiàn)信號失真。在對多組信號進(jìn)行測量時，為了保證測量的一致性，3個設(shè)定好的增益值是不能改變的。因此，需要用正常肉樣品觀察信號是否太弱，用注水比例為14%的肉樣品觀察是否發(fā)生了失真，從而確定3個增益的合理取值。

（4） 設(shè)置采樣頻率（SW）、回波時間 （TE） 和回波個數(shù)（NECH）。信號的采樣頻率不能太小，太小將導(dǎo)致部分信號的丟失，太大將使信噪比變小，弱的信號將被噪聲淹沒。采用CPMG序列測量NMR信號隨時間的變化曲線時，采樣時間要足夠長，使樣本的橫向弛豫在采樣時間內(nèi)已經(jīng)基本完成。采樣時間由TE和NECH這2個參數(shù)的乘積決定。在保證采樣時間足夠長的前提下，選取的回波個數(shù)越多，回波時間就越短?；夭▊€數(shù)多，采集的數(shù)據(jù)多，得到的NMR信號隨時間的變化曲線更準(zhǔn)確。但是，隨著回波個數(shù)的增多，回波時間的變短，信噪比變小，又將影響NMR信號測量的精度。需要用正常肉樣進(jìn)行預(yù)試驗，找到合適的SW，TE和NECH。

1.4.2 NMR信號的采集及測量

從冰箱中取出冷藏6 h的樣品，將裝入自封袋的樣品置于32℃恒溫水浴箱中20 min，使肉溫達(dá)到32℃。將肉樣品置于專門設(shè)計的動物床上，并使用低場核磁共振成像分析儀進(jìn)行NMR信號的采集和測量。每個樣品重復(fù)測量2次。所選射頻脈沖序列為CPMG序列，根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，將序列參數(shù)設(shè)置如下：TW=6 000 ms， RFD=0.1 ms， PRG=2， RG1=20.0 db，DRG1=3，SW=100 kHz，TE=0.22 ms，NECH=18 000，NS=8。

1.5 數(shù)據(jù)的處理與分析

采用磁共振分析軟件Ver 4.0對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行多組分反演，得到每個肉樣品的橫向弛豫譜及相對應(yīng)的弛豫譜參數(shù)的值。

由于每組有3個平行樣品，每個樣品重復(fù)測量了2次。因此，最終的數(shù)據(jù)要取它們的平均值。共得到70組數(shù)據(jù)。

應(yīng)用軟件IBM SPSSStatistics 24對70組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用判別分析法建立檢測注水肉的模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉樣品的NMR信號和橫向弛豫譜

5種不同注水比例的肉樣品的NMR信號隨時間的變化曲線見圖1。

圖1 5種不同注水比例的肉樣品的NMR信號隨時間的變化曲線

NMR信號隨時間衰減，注水比例不同的肉樣品產(chǎn)生的信號大小不同，衰減的速度不同。注水比例大的肉樣品產(chǎn)生的NMR信號較強(qiáng)，衰減的速度較慢。

5種不同注水比例的肉樣品的橫向弛豫譜見圖2。

每個肉樣品的橫向弛豫譜一般由3個峰組成，這3個峰對應(yīng)于3種不同狀態(tài)的水，它們分別是結(jié)合水，不易流動水和自由水[9]。橫向弛豫譜的3個峰的面積、總峰面積、每個峰面積占總面積的比例，以及3個峰的起點、頂點和終點對應(yīng)的橫向弛豫時間均稱為橫向弛豫譜參數(shù)，共有16個橫向弛豫譜參數(shù)。從圖2可以看出不同注水比例的肉樣品的橫向弛豫譜參數(shù)存在差異。

圖2 5種不同注水比例的肉樣品的橫向弛豫譜

2.2 用判別分析法建立注水肉檢測模型

判別分析是利用已知類別的樣本建立判別模型，對未知類別的樣本進(jìn)行判別的一種統(tǒng)計方法。判別分析的特點是根據(jù)已掌握的每個類別的若干樣本的數(shù)據(jù)信息，總結(jié)出客觀事物分類的規(guī)律性，建立判別公式和判別準(zhǔn)則，當(dāng)遇到新的樣本時，根據(jù)總結(jié)出來的判別公式和判別準(zhǔn)則，就能判別該樣本所屬的類別[10]。使用判別分析的關(guān)鍵點有2點，一是測量樣品的各種屬性在各類別之間是否存在顯著差異；二是哪些屬性適合用來判別分類。試驗將肉樣品按注水比例0，2%，6%，10%，14%分為5個類別，分別用1～5的5個數(shù)字來表示。試驗可以得到每個樣品的16個橫向弛豫譜參數(shù)值，這些參數(shù)值中的絕大多數(shù)隨注水比例發(fā)生規(guī)律性變化，且在5個不同類別間存在顯著差異，可以用這些參數(shù)值為區(qū)分注水比例提供信息。不同的橫向弛豫譜參數(shù)區(qū)分注水比例的能力不同，總峰面積、不易流動水比例、自由水比例及自由水峰的3個弛豫時間區(qū)分注水比例的能力較強(qiáng)，可用這些參數(shù)作為預(yù)測變量建立判別函數(shù)[8]。

考慮到預(yù)測變量的無多重共線性的要求，最終選擇總峰面積S，自由水比例P23和自由水峰終點對應(yīng)的橫向弛豫時間T23e作為預(yù)測變量，通過對測量樣本的訓(xùn)練，建立判別函數(shù)，實現(xiàn)對不同注水比例的注水肉的區(qū)分。

2.2.1 驗證預(yù)測變量

組平均值的同等檢驗見表1。

表1是組平均值同等檢驗的結(jié)果，Wilks'Lambda值在0～1，數(shù)值越小，類別之間的差異越大。從表1中可以看出總峰面積S的Wilks'Lambda值最小，即類別之間的差異最大，其次是自由水比例P23。類別之間差異最小的是自由水峰終點對應(yīng)的橫向弛豫時間T23e。由于S，P23，T23e三者的顯著性均小于0.05，說明這3個參數(shù)適合作為判別分析的預(yù)測變量。

2.2.2 建立判別模型

判別分析的方法有3種，分別為距離判別、Fisher判別和Bayes判別。采用適合于多組判別的Bayes準(zhǔn)則進(jìn)行判別分析。1，2，3，4，5分別表示注水比例為0，2%，6%，10%，14%的5個類別，選擇S，P23，T23e為3個預(yù)測變量，將試驗測得的70組數(shù)據(jù)全部作為訓(xùn)練樣本，得到如表2所示的分類函數(shù)系數(shù)。利用分類函數(shù)系數(shù)建立Bayes判別函數(shù)，用以區(qū)分不同注水比例的5類肉樣品。

分類函數(shù)系數(shù)見表2。

表1 組平均值的同等檢驗

表3 回代驗證和交叉驗證的統(tǒng)計結(jié)果

表2 分類函數(shù)系數(shù)

根據(jù)表2中的分類函數(shù)系數(shù)建立的貝葉斯判別函數(shù)為：

將每個訓(xùn)練樣品的預(yù)測變量值分別代入到5個判別函數(shù)中，計算出每個函數(shù)值。比較這些函數(shù)值，函數(shù)值最大的就是肉樣品被分類的類別。根據(jù)Bayes判別函數(shù)和待檢測肉樣品的預(yù)測變量值，就可以實現(xiàn)對肉樣品按注水比例進(jìn)行分類。

2.2.3 判別效果驗證

通過回代驗證和交叉驗證對Bayes判別模型的效果進(jìn)行驗證?；卮炞C是指將每個訓(xùn)練樣品的3個預(yù)測變量值代入已建立的Bayes判別函數(shù)中，進(jìn)行重新分類。交叉驗證是指先將一個訓(xùn)練樣品去除，利用剩余的訓(xùn)練樣品數(shù)據(jù)重新建立判別函數(shù)，再利用該判別函數(shù)對去除的樣品進(jìn)行分類。不斷重復(fù)，直到完成對所有原訓(xùn)練樣品的重新分類。重新分類的結(jié)果越接近實際分類，判別效果越好。

回代驗證和交叉驗證的統(tǒng)計結(jié)果見表3。

從表3可以看出，回代驗證的正確率為94.3%，交叉驗證的正確率為91.4%，2種驗證方法得到的正確率都很高且接近，模型穩(wěn)定?；卮炞C的結(jié)果，出現(xiàn)了4個錯誤判斷。1個屬于第1類的正常肉樣品被誤判為注水比例為2%的第2類；2個屬于第2類的注水比例為2%肉樣品被誤判為第1類，1個屬于第5類的14%的注水肉被誤判為第4類。交叉驗證的結(jié)果，發(fā)生了6個錯誤判斷。1個屬于第1類的正常肉樣被誤判為第2類；2個屬于第2類的2%注水肉被誤判為第1類；1個屬于第3類的6%的注水肉被誤判為第2類；2個屬于第5類的14%注水肉被誤判為第4類。

3 結(jié)論

采用低場核磁共振技術(shù)，用CPMG序列測量肉樣品的NMR信號，經(jīng)反演后得到每個肉樣品的橫向弛豫譜及對應(yīng)的16個橫向弛豫譜參數(shù)。以總峰面積S，自由水比例P23和自由水峰終點對應(yīng)的橫向弛豫時間T23e作為預(yù)測變量，對測量的訓(xùn)練肉樣品進(jìn)行判別分析，建立的Bayes判別模型能夠?qū)崿F(xiàn)對注水肉的注水比例的分組識別。將建立判別模型的訓(xùn)練樣本數(shù)從15個增加到70個時[8]，對模型的回代驗證和交叉驗證的正確率從88%提高到了94.3%和91.4%。說明增加建立模型的訓(xùn)練樣本量，能夠有效提高模型識別的正確率。