繆曉剛，阿布都艾尼·熱吾提，王利，瓦熱斯江·尼亞孜，郭子剛，王浩

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心創(chuàng)傷病區(qū)，新疆 烏魯木齊 830001)

骨肉瘤也叫成骨肉瘤，是最常見的骨惡性腫瘤，常發(fā)生在20歲以下的青少年或者兒童[1]。骨肉瘤多見于長骨干骺端，約3/4發(fā)生在股骨下端及脛骨上端，極少數(shù)發(fā)生在手和足等四肢末端骨。骨肉瘤預后較差，未發(fā)生轉移的骨肉瘤患者，5年生存率可達70%左右；而轉移或者復發(fā)患者5生存率低于20%[2-3]。因此，針對骨肉瘤生長和轉移的分子機制研究將為該病的治療提供新的分子標記物和治療靶點?；|(zhì)金屬蛋白酶11(matrix met alloproteinase-11，MMP-11)是MMP家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)其與多種人類腫瘤轉移及預后密切相關，對腫瘤的分子治療有重要的參考價值[4-5]。Nonsrijun等[6]發(fā)現(xiàn)MMP-11的表達與前列腺癌預后密切相關，高表達MMP-11患者提示預后不良；Yan等[7]報道低表達MMP-11胃癌患者5年生存率較高表達MMP-11患者明顯升高；Hsin等[8]揭示MMP-11在舌癌中呈現(xiàn)高表達，過表達MMP-11可促進腫瘤細胞侵襲；此外Iwasaki等[9]報道過表達MMP-11可促進卵巢癌細胞惡性轉移。目前關于MMP-11在骨肉瘤的研究尚未見相關文獻報道，本研究旨在檢測MMP-11在骨肉瘤和癌旁組織中的表達特征，并探究敲低其表達對骨肉瘤細胞增殖、遷移及凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 標本收集 2012年1月至2014年12月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心收集40例骨肉瘤及配對的癌旁骨組織標本，每一例標本均經(jīng)本院病理科進行病理確診。標本的收集經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會認可并獲得患者知情同意。40例標本中男性20例，平均年齡(52.61±3.42)歲；女性20例，平均年齡(51.77±4.58)歲。

1.2 RNA提取和逆轉錄反應 總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司。選取液氮保存的40例配對骨肉瘤及癌旁組織，依照Trizol試劑盒說明書，提取組織中的總RNA。遵照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明將l μg RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s，隨后放置-80℃保存。

1.3 熒光定量PCR(Quantitative RT-PCR) 參照SYBR?Premix EX TaqTM ⅡPCR Kit試劑盒說明書，以合成的cDNA作為模版在LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀上進行熒光定量PCR反應。反應總體系為：模版cDNA 1 μL，2×SYBR?Premix Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNase-free water 8 μL。MMP-11上游引物為5’-TGGGATAGACACCAATGAGATT-3’，下游引物為5’-AGCCCGCTTTGAAGAA-3’；以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH上游引物為5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游引物為5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。反應條件為：98℃ 10 min，隨后98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45個循環(huán)。

1.4 蛋白質(zhì)印跡 參照RIPA(radio-immunoprecipitation assay)蛋白裂解試劑說明書，提取骨肉瘤細胞的總蛋白。采用BCA(bicinchoninic acid)定量試劑盒將提取好的總蛋白定量到2 μg/μL，按比例加入5×SDS上樣緩沖液，105 ℃加熱15 min使其完全變性。常規(guī)制備10% SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量25 μL，隨后電泳、轉膜、封閉，加入抗MMP-11(ab119284，1︰1 000稀釋)及GAPDH抗體(ab8245，1︰2 000稀釋)，4℃過夜并室溫孵育相應的二抗1 h，隨后使用TBST(tris-buffered saline with tween 20)洗滌3次，ECL(electro-chemi-luminescence)發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片。

1.5 免疫組化染色 骨肉瘤及癌旁骨組織石蠟切片采用0.25% H2O2液處理20 min脫蠟。山羊血清于37℃孵育30 min后，加抗MMP-11兔多克隆抗體，后置于4℃冰箱過夜。加入生物素標記的二抗在37℃孵育60 min，隨后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素孵育30 min，最后DAB顯色約1 min，顯微鏡下觀察。

1.6 細胞培養(yǎng)和轉染 骨肉瘤細胞系(HOS和Saos-2)購自中科院上海細胞庫。細胞培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清FBS均購自美國Invitrogen公司。細胞采用DMEM+10%FBS在37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。MMP-11 siRNA及陰性對照(siRNA control)合成于上海吉瑪基因公司。取對數(shù)期生長的細胞進行鋪板，采用Lipofetamine 3000轉染試劑進行細胞轉染，其中試驗組轉染MMP-11 siRNA，陰性對照組轉染siRNA control。48 h后收集細胞，提取RNA和蛋白質(zhì)，采用熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡觀察兩組細胞中MMP-11的表達變化。

1.7 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT) 取對數(shù)期生長的骨肉瘤細胞按照96孔板進行鋪板，并使每孔細胞數(shù)達到6 500個。試驗組轉染MMP-11 siRNA，陰性對照組轉染siRNA control，并連續(xù)4 d每天每孔加入15 μL MTT (5 mg/mL，Sigma，USA)與細胞共孵育4 h后棄上清，最后使用150μL二甲基亞砜(DMSO，Sigma，USA)溶解，并測各孔480 nm波長的吸光度。

1.8 細胞劃痕試驗 取對數(shù)期生長的骨肉瘤細胞按照6孔板進行鋪板，并使每孔細胞數(shù)約為3.0×105個。當細胞完全貼壁后，用10μL槍頭按比例劃出4條橫線。隨后，試驗組轉染MMP-11 siRNA，陰性對照組轉染siRNA control，細胞轉染后每隔4 h進行拍照，觀察和測定劃痕寬度。

1.9 流式細胞儀技術 將對數(shù)期生長細胞使用6孔板進行鋪板，并轉染MMP-11 siRNA或siRNA control 48 h后參照AnnexinV FITC試劑盒說明書(invitrogen，USA)處理細胞，隨后采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 MMP-11在骨肉瘤及配對的癌旁組織表達特征 經(jīng)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中MMP-11 mRNA的表達量較癌旁組織明顯升高，以癌旁組織中MMP-11 mRNA的表達量為(1.0±0.22)，則其在骨肉瘤組織中相對表達量為(3.94±0.79)(P<0.05)。免疫組化染色亦顯示MMP-11蛋白在骨肉瘤組織的陽性率顯著高于癌旁組織(見圖1，P<0.05)。

圖1 免疫組化染色檢測MMP-11在骨肉瘤及配對的癌旁組織的表達強度(×200)

2.2 體外轉染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細胞內(nèi)源性MMP-11表達的影響 結果發(fā)現(xiàn)，轉染MMP-11 siRNA后HOS和Saos-2細胞中MMP-11 mRNA的表達水平分別為siRNA control組的(0.22±0.12)倍和(0.46±0.15)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡亦顯示轉染MMP-11 siRNA后HOS和Saos-2細胞中MMP-11蛋白的表達水平分別為siRNA control組的(0.17±0.09)倍和(0.41±0.16)倍，差異有統(tǒng)計學意義(見圖2，P<0.05)。上述結果表明，MMP-11 siRNA可有效降低骨肉瘤細胞內(nèi)源性MMP-11表達水平。

圖2 體外轉染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細胞內(nèi)源性MMP-11蛋白表達的影響

2.3 體外轉染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細胞增殖的影響 細胞增殖曲線顯示，MMP-11 siRNA轉染組骨肉瘤細胞增殖速度較siRNA control組明顯降低，轉染MMP-11 siRNA 2和3 d后HOS細胞生長抑制率分別為(13.52±5.24)%和(18.66±6.55)%(見圖3，P<0.05)；Saos-2細胞轉染MMP-11 siRNA 1、2和3 d后細胞生長抑制率分別為(9.39±3.72)%、(15.43±4.86)%和(21.57±7.01)%(見圖3，P<0.05)。

注：*為P<0.05

2.4 體外轉染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細胞遷移的影響 采用細胞劃痕試驗觀察敲低MMP-11對骨肉瘤細胞遷移的影響。結果見圖4。轉染MMP-11 siRNA 24 h后HOS細胞劃痕閉合約(36.23±11.56)%，而轉染siRNA control 24 h后HOS細胞劃痕閉合約(78.19±15.71)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；轉染MMP-11 siRNA 24 h后Saos-2細胞劃痕閉合約(31.55±7.26)%，而轉染siRNA control 24 h后Saos-2細胞劃痕閉合約(89.65±21.86)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 體外轉染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細胞遷移的影響

2.5 體外轉染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細胞凋亡的影響 MMP-11 siRNA組HOS細胞的凋亡率為(7.78±3.31)%，而siRNA control組HOS細胞的凋亡率為(3.12±1.09)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MMP-11 siRNA組Saos-2細胞的凋亡率為(10.63±3.90)%，而siRNA control組Saos-2細胞的凋亡率為(2.57±1.41)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix met alloproteinases，MMPs)是一類依賴Zn2 +離子的內(nèi)肽酶家族，具有降解細胞外基質(zhì)的作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs可參與多種生理及病理過程，包括結構重塑、基質(zhì)降解、炎性反應、細胞生長及血管生成等[12-13]。目前MMPs根據(jù)底物和結構域可劃分為5大類：明膠酶、膠原酶、膜型金屬蛋白酶、間質(zhì)溶解素及類膜基質(zhì)蛋白酶。近年來，MMPs在腫瘤中的研究日益增多，并發(fā)現(xiàn)其與腫瘤生長、轉移、浸潤及預后密切相關[10]。例如，MMP-7可降解細胞膜上的死亡配體，進而抑制死亡受體介導的細胞凋亡，促進腫瘤細胞生長[14]；MMP-2和MMP-9的表達在浸潤性乳腺癌組織顯著高于癌旁組織和良性病變組織[15]；結腸癌組織中MMP-2和MMP-9表達水平及陽性率均顯著高于癌旁正常組織[16]；此外低表達MMP-10宮頸癌患者預后明顯好于高表達MMP-10患者[17]。

MMP-11是MMPs中的一員，研究發(fā)現(xiàn)其與多種人類腫瘤轉移及預后密切相關，對腫瘤的分子治療有重要的參考價值。目前關于MMP-11在骨肉瘤的研究尚未見相關文獻報道。本研究以MMP-11為主要研究對象，通過采用熒光定量PCR和免疫組化染色分析我院骨科中心40例骨肉瘤及癌旁組織中MMP-11的表達特征，首次發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中MMP-11 mRNA和蛋白的表達量較癌旁組織明顯升高，上述結果與MMP-11在其他腫瘤組織的表達相符，提示高表達MMP-11在骨肉瘤中可能發(fā)揮促癌作用。

為了證實上述科學假設，我們委托上海吉瑪基因公司合成MMP-11小干擾RNA(siRNA)和陰性對照(siRNA control)，并體外轉染至骨肉瘤細胞。結果發(fā)現(xiàn)，轉染MMP-11 siRNA可有效降低骨肉瘤細胞內(nèi)源性MMP-11 mRNA和蛋白表達水平，提示MMP-11 siRNA可靶向敲低MMP-11的表達，進一步用于觀察其對骨肉瘤細胞增殖、遷移及凋亡的影響。隨后MTT、細胞劃痕試驗以及流式細胞術發(fā)現(xiàn)，敲低MMP-11的表達可顯著抑制HOS和Saos-2細胞的增殖及遷移能力，并增加細胞凋亡。上述結果強烈提示高表達MMP-11作為致癌基因促進骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MMP-11在骨肉瘤中呈現(xiàn)高表達，并初步揭示敲低MMP-11的表達可顯著抑制HOS和Saos-2細胞的增殖及遷移能力，并增加細胞凋亡，提示高表達MMP-11在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用。