段群棚，秦毅斌，盧冰霞，何 穎，陳忠偉，周英寧，李 斌，梁家幸，閉炳芬，蔣冬福，蘇乾蓮，盧敬專，趙 武

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，南寧 530001）

偽狂犬?。╬seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染豬、牛、羊等多種家畜和野生動物引起的，以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、腦脊髓炎為主要特征的一種高度接觸性傳染病。PRV能感染多種宿主，但豬是其主要天然宿主、貯存者和傳播者[1-3]。gE基因是PRV的非必需基因，當gE基因被刪除后，病毒毒力降低，但不會影響病毒的復制擴增和免疫原性[4]，因此gE基因是一個良好的標記基因。gE蛋白是PRV所有野毒株表達的一類糖蛋白，在被PRV野毒感染的豬體內(nèi)能檢測到gE蛋白抗原及抗體，這為利用分子生物學和血清學方法進行PRV 野毒感染和gE基因缺失疫苗免疫接種的鑒別診斷提供了條件[5]。

我國從20世紀90年代開始在規(guī)模豬場大量使用PRV gE基因缺失弱毒疫苗，使豬偽狂犬病得到有效控制。但自2011年以來，我國不同地區(qū)豬場相繼出現(xiàn)接種 PRV 基因缺失弱毒疫苗后仍發(fā)生PR的現(xiàn)象，因此加強豬場PR的監(jiān)測及防控對促進和保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展有重要意義[6-8]。本實驗室于2013年1月～2016年12月，采用 gE-ELISA法對來自壯族自治區(qū)14個地級市部分規(guī)模豬場送檢血清樣品進行PRV gE抗體檢測，并對不同年份、不同季度、不同區(qū)域、不同階段豬群的偽狂犬野毒感染情況進行調(diào)查分析，以全面了解廣西規(guī)模豬場PRV野毒感染情況和流行態(tài)勢，為豬場防控和凈化PR提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑盒 美國IDEXX公司的PRV gE抗體檢測試劑盒購自北京愛德仕元亨生物科技有限公司。

1.1.2 血清樣品來源 2013年1月～2016年12月，廣西14個地級市290個規(guī)?；i場共送檢8676份血清樣品，受檢豬場均免疫PRV gE缺失疫苗。為便于進行血清流行病學調(diào)查統(tǒng)計，將受檢豬群分為6種不同階段類別: 新生仔豬（1～4周齡）、保育仔豬（4～8周齡）、育肥豬（9周齡及以上）、后備母豬、母豬、公豬。

1.2 方法

1.2.1 血清樣品的制備 經(jīng)豬前腔靜脈或耳緣靜脈采集3～5 mL非抗凝血液，室溫靜置2～4 h后，5000×g離心3～5 min，取上清置于離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PRV gE 抗體檢測方法 血清樣品PRV gE抗體檢測嚴格按照 IDEXX 公司生產(chǎn)的 PRV gE 抗體檢測試劑盒說明書進行。

1.2.3 結(jié)果判定與分析 本實驗室檢測的豬血清樣品均來自使用PRV gE基因缺失疫苗免疫的豬場，因此在進行PRV野毒感染陰陽性豬場結(jié)果判定和統(tǒng)計時，只要豬場出現(xiàn)一個陽性樣品，該豬場則判定為PRV野毒感染陽性豬場。應(yīng)用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對檢測結(jié)果數(shù)據(jù)進行卡方檢驗（χ2檢驗），統(tǒng)計分析其差異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 2013～2016年廣西受檢豬場PRV gE抗體檢測結(jié)果對來自廣西14個地級市290個規(guī)模豬場的8676份血清樣品進行PRV gE抗體檢測，受檢豬場PRV gE抗體陽性場為48.97%，受檢血清樣品的PRV gE抗體陽性率為22.56%。2013～2016年P(guān)RV野毒感染的豬場陽性率和血清樣品陽性率均呈逐年上升趨勢，2014年血清樣本陽性率上升尤其明顯具體結(jié)果詳見表1。

王喜嬌等[9]調(diào)查結(jié)果顯示，2010～2013年廣西豬場陽性場23.00%、血清樣本陽性率5.16%。本次調(diào)查結(jié)果中豬場陽性率與血清樣本陽性率均呈現(xiàn)大幅度上升，表明廣西規(guī)模豬場豬PRV野毒感染呈逐年上升趨勢，感染程度越發(fā)嚴重。唐小明等[10]報道2014～2015年湖南豬場陽性率61.22%，血清樣本陽性率23.56%。黨占國等[11]報道2012～2015年我國部分地區(qū)豬場陽性率99.2%，血清樣品陽性率43.9%，相比較而言，本次調(diào)查結(jié)果表明廣西豬場PRV野毒感染在我國還處于相對較低水平。張顯浩等[12]報道PRV野毒感染在我國豬場中普遍存在，但不同豬場感染率存在一定差異。近年來廣西豬場PRV野毒感染陽性率、血清樣本陽性率均呈逐年上升態(tài)勢，相應(yīng)的臨床病例發(fā)生也有所抬頭，PR的防控形勢嚴峻，因此必須加強豬場PR綜合防控和凈化工作。

表1 2013～2016年廣西部分規(guī)模豬場PRV gE抗體檢測結(jié)果Table 1 Detection of Pseudorabies virus gE antibody in serum of swine sample from pig farms of Guangxi during 2013-2016

2.2 2013～2016年廣西不同區(qū)域受檢豬場 PRV野毒感染情況本研究統(tǒng)計的血清樣品來自廣西14個地級市290個規(guī)模豬場。由表2可知，廣西14個級市均存在偽狂犬野毒感染，但感染程度有所不同，與王喜嬌等[9]調(diào)查結(jié)果一致。南寧、玉林、柳州、桂林、貴港市為送檢血清樣品較多的5個地級市，同時也是廣西養(yǎng)豬密集區(qū)（規(guī)模豬場較多），豬場陽性率分別為64.49%、43.75%、28.57%、33.33%、55.56%，樣品陽性率分別為33.80%、13.62%、6.93%、6.84%、34.38%。其中南寧、貴港市豬場陽性率、樣品陽性率均高于廣西平均水平。根據(jù)采樣調(diào)查結(jié)果，南寧、貴港市送檢血清樣品多來自中小規(guī)模豬場，而中小規(guī)模豬場多存在生物安全意識淡薄及措施不到位、引種檢疫不嚴、疫苗免疫程序不合理等諸多疫病防控缺陷，導致PRV野毒感染率偏高，這與文獻報道的中小型規(guī)模豬場PRV野毒感染率較高[10,13]研究結(jié)論相一致。應(yīng)針對PR的發(fā)病與防控特點，做好豬場PR的綜合防控及凈化工作。

表2 2013～2016年廣西不同區(qū)域受檢豬場 PRV野毒感染情況Table 2 Infections of PRV wild strain in the pig farms from different regions of Guangxi during 2013-2016

2.3 2013～2016年廣西受檢豬場不同階段豬群PRV gE抗體檢測結(jié)果取能明確豬齡的豬血清6771份，對不同階段豬群PRV gE抗體陽性率檢測結(jié)果進行分類統(tǒng)計。結(jié)果顯示，不同年份不同階段豬群對PRV野毒感染程度均不同，2013～2016年，公豬、后備母豬、母豬、哺乳仔豬、保育豬、育肥豬的PRV gE抗體總陽性率分別為38.50%、25.89%、23.72%、25.86%、21.16%、18.72%； 2013年、2014年后備母豬PRV gE抗體陽性率最高，2015年、2016年公豬PRV gE抗體陽性率最高。2013～2016年，公豬、母豬、哺乳仔豬、保育豬、育肥豬PRV gE抗體陽性率呈逐漸上升趨勢；后備母豬PRV gE抗體陽性率從2013～2015年呈逐漸上升趨勢，而2016年P(guān)RV gE抗體陽性率則呈下降態(tài)勢（詳見表3）。χ2檢驗結(jié)果表明，2013～2016年廣西部分規(guī)模豬場不同階段豬群間的PRV gE抗體陽性率差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

根據(jù)廣西受檢豬場不同生長階段豬的PRV gE血清抗體檢測結(jié)果可知，不同生長階段豬群對PRV均易感。公豬、后備母豬、母豬等種豬PRV野毒感染率較高，育肥豬PRV野毒感染率最低，而哺乳仔豬與母豬PRV野毒抗體陽性率比較接近，表明哺乳仔豬的PRV野毒抗體很可能來自PRV野毒母源抗體。哺乳仔豬、保育豬、育肥豬PRV野毒抗體逐漸降低，很可能原因是來自母豬的PRV野毒母源抗體隨著時間逐漸消失所致，這與王科文等[14]調(diào)查結(jié)果與其相吻合，自然條件下PRV野毒母源抗體在120 d左右才消失。種豬PRV gE野毒抗體感染率高則是由于種豬飼養(yǎng)周期較長，一旦感染PRV野毒，可長期帶毒排毒，引起持續(xù)性感染，而且規(guī)模種豬場通常采用人工授精，只要1頭種公豬感染PRV，便可通過人工授精的方式在種母豬群擴散，也是整個豬場持續(xù)陽性的根本原因[9,12]。

2.4 2013～2016年廣西受檢規(guī)模豬場PRV野毒感染陽性比例分布調(diào)查對受檢豬場血清樣本PRV gE抗體陽性率進行區(qū)間比例統(tǒng)計，了解PRV野毒感染豬場的感染程度。結(jié)果顯示，2013～2016年受檢豬場的PRV gE抗體陰性豬場比例分別為72.46%、52.73%、43.84%、39.78%，PRV gE抗體陰性豬場比例呈逐年下降趨勢，也即PRV gE抗體陽性豬場比例呈逐年上升趨勢。受檢豬場血清樣本gE抗體陽性率在50.0%以上的豬場比例，2013年為2.90%（2/69）、2014年為16.36%（9/55）、2015年為24.66%（18/73）、2016年為26.88%（25/93），表明受檢廣西規(guī)模豬場PRV野毒感染程度呈逐年上升趨勢（詳見表4）。

目前，加強豬場生物安全措施以及科學使用疫苗免疫接種仍是防控豬PR的主要方法。在豬群科學使用PRV gE基因缺失疫苗，能有效地阻止病毒擴散，降低排毒量，縮短排毒時間，減少帶毒豬只。同時定期開展血清抗體監(jiān)測，制定合理的免疫程序，及時淘汰PRV gE抗體陽性豬，確保疫苗的免疫保護效果，最終達到凈化目的。但是僅依靠疫苗免疫并不能徹底控制PR的發(fā)生與流行，對于規(guī)模豬場來說，實施PR防控和凈化需要有一整套符合豬場實際的可操作性的綜合實施方案。該實施方案除了疫苗免疫外，應(yīng)主要包括以下較高水平的飼養(yǎng)管理和生物安全措施：堅持自繁自養(yǎng)，引種前檢疫，確保引進的公豬、后備母豬均未感染PRV野毒；豬群配套使用PRV gE抗體檢測試劑盒，定期檢測PRV gE抗體，堅決淘汰已感染PRV野毒的種豬，有計劃的實行種豬PRV的凈化工作，逐步淘汰清除PRV gE陽性抗體種豬，降低種豬群的PRV野毒抗體陽性率至陰性狀態(tài)，并引入PRV gE陰性抗體種豬，最后達到在豬場中清除gE陽性種豬群和PRV感染豬群，達到凈化目的。加強飼養(yǎng)管理，做好其他重要常規(guī)疫苗免疫，降低其他疫病的感染，提高豬群的整體健康水平和免疫力；實行嚴格的消毒措施（包括豬舍、進入豬場人員、車輛和工具等），禁止一切PRV可能攜帶者（包括所有能感染PRV的家禽和野生動物及相關(guān)物品）進入豬場等。

表3 2013～2016年廣西受檢豬場不同階段豬群PRV gE抗體檢測結(jié)果Table 3 Detection of the PRV gE antibody in different kinds of pigs from pig farms in Guangxi during 2013-2016

表4 2013～2016年廣西受檢規(guī)模豬場PRV野毒感染陽性比例分布統(tǒng)計結(jié)果Table 4 Statistical results of PRV field virus infection positive proportional distribution from the examined large scale pig farms of Guangxi Province in different during 2013-2016

本次廣西受檢豬場均接種了PRV gE 基因缺失疫苗，但近年來受檢豬場的PRV野毒感染率卻呈逐年上升態(tài)勢，分析可能與豬場的PR綜合防控措施不到位，豬場沒有實施PRV凈化措施，豬場種豬群帶毒，也可能因帶毒豬長期免疫因免疫壓力產(chǎn)生病毒變異等因素相關(guān)，國內(nèi)已有報道當前可能存在PRV流行毒株出現(xiàn)變異情況[15-17]，這也說明豬場搞好PR防控與凈化工作的緊迫性，豬場須做好PR的免疫、檢測、淘汰、替換、清群為主要內(nèi)容的PR防控與凈化技術(shù)措施。