王 艷，何再平，黃忠榮，張磊萍，王 權(quán)，蔣 蔚

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）為革蘭氏陰性菌，通常被稱為嗜鹽菌[1-2]。VP廣泛分布于海水和海底沉積物及魚(yú)、蝦、貝類等海產(chǎn)品中，是造成海產(chǎn)品食源性疾病的重要病原菌之一。在中國(guó)、日本等許多亞洲國(guó)家，美國(guó)以及歐洲一些國(guó)家，經(jīng)常發(fā)生食用副溶血弧菌感染的海產(chǎn)品引發(fā)的食品中毒事件[3]，VP感染已成為全球性嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[4-5]。因此建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏和特異性較高的檢測(cè)方法對(duì)社會(huì)公共衛(wèi)生安全和水產(chǎn)養(yǎng)殖至關(guān)重要。

耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH）是副溶血弧菌的重要毒力因子，能夠產(chǎn)生溶血毒性。攜帶TDH的菌株能夠在莪萋氏血瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生β溶血現(xiàn)象即奈川現(xiàn)象。TDH除具備溶血作用外，還具備致死作用及細(xì)胞毒性等生物學(xué)活性[6-13]。

目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的副溶血弧菌耐熱TDH的檢測(cè)方法主要以KP實(shí)驗(yàn)、多重PCR技術(shù)、熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)為主，但這些方法需要檢測(cè)人員具備一定的儀器操作技能，不太適合基層檢測(cè)。Dot-ELISA檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單，儀器設(shè)備要求低，靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)副溶血弧菌TDH進(jìn)行了表達(dá)、純化和抗體制備[14]，在此基礎(chǔ)上，本研究建立了致病性副溶血弧菌Dot-ELISA方法，并對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的部分臨床分離株和水產(chǎn)品分離株進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較，探究Dot-ELISA法的實(shí)用性和推廣價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株和血清副溶血弧菌ATCC33847株（TDH陽(yáng)性菌，TDH+）購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；副溶血弧菌ATCC17802（TDH陰性菌，TDH-）和創(chuàng)傷弧菌ATCC27562購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；其余副溶血弧菌由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存；嗜水氣單胞菌、大腸桿菌O157和沙門(mén)菌為本實(shí)驗(yàn)室保存；副溶血弧菌TDH的免疫血清由本實(shí)驗(yàn)室研制[14]。

1.2 試劑和耗材蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；DNA Marker 購(gòu)自大連寶生物公司；2×PCR TaqMix 購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；HRP-羊抗兔IgG 和DAB底物顯色液試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；PVDF膜為美國(guó)Milipore公司產(chǎn)品；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 Dot-ELISA方法的操作程序?qū)⒓?xì)菌接種于牛肉湯培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)16～18 h后，取1 mL于離心管中，沸水中煮沸10 min，恢復(fù)至室溫并混勻。剪取適當(dāng)大小的PVDF膜，用鉛筆畫(huà)邊長(zhǎng)為1 cm的方格，在甲醇中浸泡2～5 min，自然風(fēng)干。取5 μL菌液點(diǎn)于方格中間，37℃烘干。將已點(diǎn)樣的PVDF膜浸入脫脂乳中封閉1 h后，用PBST漂洗3次，每次5 min；加入TDH抗血清37℃孵育，用PBST漂洗3次，每次5 min；將膜浸入HRP-羊抗兔IgG中反應(yīng)，用PBST漂洗3次，每次5 min；將PVDF膜放于干凈的平皿中，DAB中避光顯色，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。副溶血弧菌ATCC33847株（TDH+）和ATCC17802（TDH-）分別為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，牛肉湯培養(yǎng)基為空白對(duì)照。膜上出現(xiàn)明顯、規(guī)則的棕色斑點(diǎn)者判為陽(yáng)性，無(wú)明顯斑點(diǎn)或斑點(diǎn)不清晰者判為陰性，介于兩者之間判為可疑。

1.4 Dot-ELISA方法反應(yīng)條件的優(yōu)化根據(jù)1.3中的操作步驟，對(duì)封閉液濃度（含5%、10%和20%脫脂奶的PBST）及封閉時(shí)間（30 min、1 h和2 h）、抗體工作濃度（1:50、1:100和1:200）和工作時(shí)間（30 min、1 h和2 h）、酶標(biāo)二抗?jié)舛龋?:1000、1:3000、1:5000）和作用時(shí)間（30 min、1 h和2 h）進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)顯色結(jié)果選擇Dot-ELISA方法的最佳方案。

1.5 Dot-ELISA法的特異性試驗(yàn)取副溶血弧菌株（包括TDH 陽(yáng)性和TDH陰性菌株）以及對(duì)照菌（包括創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、沙門(mén)菌），分別用副溶血弧菌TDH抗血清進(jìn)行Dot-ELSIA。

1.6 Dot-ELISA法的敏感性試驗(yàn)將純化的TDH用50 mmol/L的 Tris-HCL（pH7.5）作10倍梯度稀釋，觀察出現(xiàn)明顯斑點(diǎn)的最高稀釋倍數(shù)。

1.7 Dot-ELISA法的重復(fù)性試驗(yàn)在一批試驗(yàn)內(nèi)，相同稀釋度的樣品設(shè)立重復(fù)組，不同批次之間，對(duì)相同樣品重復(fù)試驗(yàn)，判定重復(fù)率。

1.8 Dot-ELISA法與PCR法檢測(cè)的比較選取本實(shí)驗(yàn)室保存的40株副溶血弧菌，用建立的Dot-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)采用PCR技術(shù)擴(kuò)增40株副溶血弧菌的耐熱溶血素tdh基因，對(duì)比兩種方法檢出的符合率。符合率=（共同陽(yáng)性數(shù)+共同陰性數(shù)）/所檢菌株總數(shù)×100%。PCR方法中所用擴(kuò)增tdh基因的上游引物P1：5'-CCAGGATCCATG AAACACCAATATTTTGC-3'，下游引物P2：5'-GCAGAGCTCTTATTTTTATTGTTGATGT-3'。特異性擴(kuò)增的目的片段大小為269 bp。反應(yīng)體系（25 μL）：Mix 12.5 μL，上下游引物（10 pmol/L）各1 μL，模板1 μL，用ddH2O調(diào)整終體積至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物于1.0 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳試驗(yàn)，15 min后通過(guò)紫外成像系統(tǒng)拍攝電泳圖。

2 結(jié)果

2.1 封閉液及封閉條件的優(yōu)選結(jié)果顯示，用20%脫脂乳封閉30 min，背景干凈，斑點(diǎn)清晰，重復(fù)性好，考慮到封閉是做好該實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，選擇20%脫脂乳封閉30 min為最佳封閉條件（圖1）。

圖1 封閉液及封閉條件的優(yōu)選Fig.1 Optimization of blocking solution and blocking condition

2.2 抗體工作濃度和作用時(shí)間優(yōu)選結(jié)果顯示，血清工作濃度在1:50和1:100時(shí)斑點(diǎn)比較清晰（圖2A和圖2B），工作濃度在1:200時(shí)斑點(diǎn)相對(duì)較淡（圖2C）。其中工作濃度為1:50時(shí)，反應(yīng)時(shí)間對(duì)結(jié)果影響不明顯，工作濃度在1:100時(shí)，反應(yīng)時(shí)間在30 min和1 h時(shí)結(jié)果明顯。因此，選擇抗體工作濃度為1:100，反應(yīng)時(shí)間為30 min為最佳條件。

圖2 抗體工作濃度和作用時(shí)間的優(yōu)選Fig.2 Optimization of antibody concerntration and reaction time

2.3 酶標(biāo)二抗工作濃度和作用時(shí)間優(yōu)選如圖3所示，二抗工作濃度在1:1000，反應(yīng)時(shí)間為1 h時(shí)斑點(diǎn)最清晰。因此選擇此條件為最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)條件。

2.4 特異性檢測(cè)特異性的結(jié)果顯示，只有產(chǎn)TDH陽(yáng)性副溶血弧菌可以呈現(xiàn)明顯清晰地斑點(diǎn)，而不能產(chǎn)生TDH的副溶血弧菌以及其他陰性對(duì)照菌均無(wú)斑點(diǎn)顯示（圖4），表明該方法特異性較好。

2.5 靈敏度檢測(cè)靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，當(dāng)TDH的濃度為25 μg/mL時(shí)，呈現(xiàn)較清晰的斑點(diǎn)，當(dāng)濃度為2.5 μg/mL時(shí)，僅有較淺的斑點(diǎn)顯示。所以該方法的檢測(cè)TDH的靈敏度為25μg /mL。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)同一批試驗(yàn)中相同稀釋度的樣品設(shè)立重復(fù)組（批內(nèi)），不同試驗(yàn)日對(duì)相同樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)（批間），結(jié)果重復(fù)率均為100 %。

2.7 檢測(cè)效果比較用Dot-ELISA和PCR檢測(cè)方法對(duì)40株副溶血弧菌的檢測(cè)結(jié)果（圖6），二者陰陽(yáng)性結(jié)果的符合率為82.5%（33/40），其中Dot-ELISA方法檢出陽(yáng)性率為72.5%，PCR檢測(cè)TDH的陽(yáng)性率為70%。

圖3 酶標(biāo)二抗工作濃度和作用時(shí)間優(yōu)選Fig.3 Optimization of HRP secondary antibody concentration and reaction time

圖4 Dot-ELISA特異性的檢測(cè)Fig.4 Speci ficity test of Dot-ELISA

圖5 Dot-ELISA靈敏度的檢測(cè)Fig.5 Sensitivity test of Dot-ELISA

3 討論

TDH在副溶血弧菌致病性中起著重要作用，并且在致病性副溶血弧菌不同分離株中高度保守。以TDH作為待檢抗原，可以區(qū)分致病性和非致病菌副溶血弧菌[15]。目前已有多種TDH檢測(cè)方法，比較常見(jiàn)的是用PCR檢測(cè)技術(shù)，包括常規(guī)PCR、多重PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)。孫宏迪等[16]以副溶血弧菌tdh基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)并合成引物及TaqMan探針，建立副溶血弧菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法靈敏度較高，但所需儀器較昂貴。蔣蔚等[17]建立了副溶血弧菌等的三重PCR法。何再平等[18]建立了致病性副溶血弧菌等的三重PCR檢測(cè)方法。檢測(cè)TDH的常規(guī)ELISA方法，如劉秀萍等[19]建立的一種基于多個(gè)弧菌的融合蛋白TDH-VVCVMHA的雙抗體夾心ELISA方法，可用于檢測(cè)多個(gè)弧菌的毒力蛋白。

圖6 Dot-ELISA和PCR檢測(cè)方法比較Fig.6 Comprasion of the detection results between Dot-ELISA and PCR

本研究在先期成功表達(dá)TDH重組蛋白并獲得免疫血清的基礎(chǔ)上，應(yīng)用抗TDH多抗建立了檢測(cè)副溶血弧菌TDH的Dot-ELISA檢測(cè)方法。對(duì)40份樣品用Dot-ELISA和PCR法同時(shí)檢測(cè)，相符率較高，所建立的Dot-ELISA方法既保留了常規(guī)ELISA的優(yōu)點(diǎn)，又克服了其繁瑣的缺點(diǎn)，且結(jié)果直觀，可用肉眼直接觀察，適用于具有TDH的副溶血弧菌的初步篩選，可實(shí)現(xiàn)待檢菌株的快速有效檢測(cè)[20]，為開(kāi)發(fā)副溶血弧菌快速診斷試劑盒，防控該病原菌引發(fā)的流行疫情提供了科學(xué)依據(jù)。