楊占峰，張晶晶，吳敏娜，何群力,

（1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，鄭州 451100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000）

沙門菌（Salmonella）是引起沙門菌病的病原體，屬于腸桿菌科、沙門菌屬，目前已有2600個以上的血清型被確定，主要寄居于人類和動物的腸道，可以通過侵襲腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，引起嚴(yán)重的系統(tǒng)感染，出現(xiàn)敗血癥和菌血癥，并可引起機(jī)體腹瀉、發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡[1-3]。丙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi C）是高度適應(yīng)于人類的專嗜性沙門菌，可引起嚴(yán)重的系統(tǒng)感染，導(dǎo)致副傷寒[4-5]。有數(shù)據(jù)顯示，近些年我國副傷寒沙門菌的流行有所增加，其中數(shù)次疫情與丙型副傷寒沙門菌相關(guān)[6-9]。

lpfC基因?qū)儆谏抽T菌中長極性菌毛（long polar fimbriae，LPF）操縱子家族成員之一，與LPF菌毛外膜蛋白的編碼相關(guān)[10]。有研究顯示，在腸炎沙門菌感染巨噬細(xì)胞的過程中，lpfC基因在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高[11]。本研究擬通過同源重組的方法構(gòu)建丙型副傷寒沙門菌BF02的lpfC基因缺失株，并構(gòu)建其互補(bǔ)株，對其基本生物學(xué)特性進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞及實驗動物丙型副傷寒沙門菌BF02、BF02/pkD46（Ampr）和pKD3（Cmr）、pCP20（Ampr，Cmr）、互補(bǔ)質(zhì)粒pSTV28-lpfC（Cmr）等均由本實驗室保存；人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2由本實驗室保存；8周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑2×PCP Mix、Agarose Gel DNA Extraction Kit和DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)菌微量生化發(fā)酵管購自杭州天和微生物試劑有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank中公布的丙型副傷寒沙門菌基因組序列，利用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計lpfC基因缺失引物、缺失鑒定引物及互補(bǔ)引物（表1），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.4 缺失株及互補(bǔ)株構(gòu)建以pKD3質(zhì)粒為模板，用引物lpfC缺失-F/lpfC缺失-R擴(kuò)增lpfC基因上下游同源臂的氯霉素抗性片段。根據(jù)文獻(xiàn)[12]中的方法，利用Red同源重組技術(shù)，將含有l(wèi)pfC基因上下游同源臂的氯霉素抗性片段電轉(zhuǎn)化入表達(dá)Red同源重組酶的BF02感受態(tài)細(xì)胞中，涂布氯霉素抗性平板。挑取單克隆，采用PCR及測序鑒定lpfC基因缺失株。此外，將本實驗室保存的互補(bǔ)質(zhì)粒pSTV28-lpfC電轉(zhuǎn)化入缺失株BF02ΔlpfC，構(gòu)建互補(bǔ)株BF02CΔlpfC。

1.5 缺失株生長特性測定分別挑取丙型副傷寒沙門菌野生株BF02、缺失株BF02ΔlpfC和互補(bǔ)株BF02CΔlpfC接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，次日分別轉(zhuǎn)接入10 mL的LB 液體培養(yǎng)基中（調(diào)節(jié)OD600=0.05）。37℃、220 r/min 搖振培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h測定培養(yǎng)物的OD600值，并繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.6 缺失株生化特性測定分別挑野生株BF02、缺失株BF02ΔlpfC和互補(bǔ)株BF02CΔlpfC，過夜培養(yǎng)后挑取新鮮的單菌落轉(zhuǎn)接于葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶和山梨醇等生化鑒定管，37℃過夜，觀察生化鑒定結(jié)果。

1.7 細(xì)胞黏附與侵襲試驗將新鮮培養(yǎng)菌液用DMEM洗滌后，按MOI=100感染人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中感染2 h，同時設(shè)置DMEM陰性對照組。然后以PBS洗滌3次，用0.1%的Triton-X 100裂解細(xì)胞并倍比稀釋，涂平板，進(jìn)行菌落計數(shù)，統(tǒng)計黏附試驗結(jié)果，每個菌株的黏附情況用相對于野生株的變化倍數(shù)表示。細(xì)胞侵襲試驗與細(xì)胞黏附試驗的感染方式相同，感染2 h后以無菌PBS洗滌3次，用含有慶大霉素的DMEM作用1 h殺死胞外細(xì)菌。然后用0.1%的Triton-X 100裂解細(xì)胞并倍比稀釋，涂平板，進(jìn)行菌落計數(shù)，統(tǒng)計侵襲試驗結(jié)果，每個菌株的侵襲情況用相對于野生株的變化倍數(shù)表示。

1.8 毒力試驗將野生株BF02、缺失株BF02ΔlpfC和互補(bǔ)株BF02CΔlpfC單菌落分別接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)10～12 h，以PBS洗滌細(xì)菌3次并重懸，調(diào)整細(xì)菌濃度。攻毒前先給小鼠斷水?dāng)嗍? h，然后將3種菌液分別以2×108、4× 107、8×106、1.6×106、3.2×105CFU 的劑量腹腔注射小鼠，每個劑量組5只，對照組注射PBS。連續(xù)觀察2周并統(tǒng)計小鼠死亡情況，計算3個菌株的半數(shù)致死量（lethal dose，LD50），評價其對BALB/c 小鼠的毒力。

2 結(jié)果

2.1 基因缺失株、互補(bǔ)株的構(gòu)建與鑒定挑取疑似基因缺失株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示缺失株BF02ΔlpfC內(nèi)側(cè)鑒定引物lpfC內(nèi)側(cè)-F/lpfC內(nèi)側(cè)-R無法擴(kuò)增出lpfC基因（圖1泳道4）；外側(cè)鑒定引物lpfC互補(bǔ)-F/lpfC互補(bǔ)-R可以擴(kuò)增出替換lpfC基因，大小為232 bp的氯霉素抗性片段（圖1）。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明缺失株BF02ΔlpfC構(gòu)建成功。構(gòu)建互補(bǔ)株時，內(nèi)側(cè)鑒定引物lpfC內(nèi)側(cè)-F/lpfC內(nèi)側(cè)-R和外側(cè)鑒定引物lpfC互補(bǔ)-F/lpfC互補(bǔ)-R分別擴(kuò)增出了大小為266 bp和232 bp的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致，表明互補(bǔ)株BF02CΔlpfC構(gòu)建成功。

2.2 生長曲線的測定生長曲線結(jié)果顯示，野生株BF02、缺失株BF02ΔlpfC和互補(bǔ)株BF02CΔlpfC的生長速度無顯著差異，表明lpfC基因不影響丙型副傷寒沙門菌BF02的生長速度（圖2）。

圖1 缺失株BF02ΔlpfC及互補(bǔ)株BF02CΔlpfC的鑒定Fig.1 Identi fication of BF02ΔlpfC and BF02CΔlpfC with primers

圖2 野生株BF02、缺失株BF02ΔlpfC和互補(bǔ)株BF02CΔlpfC的生長曲線Fig.2 Growth curves of wild-type strain BF02, mutant strain BF02ΔlpfC and complementary strain BF02CΔlpfC

2.3 生化特性的測定生化鑒定結(jié)果顯示，丙型副傷寒沙門菌野生株BF02、缺失株BF02ΔlpfC和互補(bǔ)株BF02CΔlpfC的生化特性一致，均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶和山梨醇，而不能發(fā)酵乳糖、蔗糖和尿素等，表明lpfC基因的缺失不影響丙型副傷寒沙門菌的生化特性。

2.4 黏附侵襲試驗黏附侵襲結(jié)果顯示，缺失株BF02ΔlpfC對Caco-2細(xì)胞的黏附侵襲能力均低于野生株BF02和互補(bǔ)株BF02CΔlpfC，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）（圖3），表明lpfC基因的缺失顯著影響丙型副傷寒沙門菌對Caco-2細(xì)胞的黏附侵襲能力。

圖3 野生株BF02、缺失株BF02ΔlpfC和互補(bǔ)株BF02CΔlpfC對Caco-2細(xì)胞的黏附侵襲能力Fig.3 Adhesion and invasion capacity of wild-type strain BF02, mutant strain BF02ΔlpfC and complementary strain BF02CΔlpfC to Caco-2 cells

2.5 毒力試驗根據(jù)bliss法計算，丙型副傷寒沙門菌BF02的LD50為3.50×106CFU，缺失株BF02ΔlpfC的LD50為1.75×107CFU，互補(bǔ)株BF02CΔlpfC的LD50為5.27×106CFU，缺失株BF02ΔlpfC的LD50是其親本野生株BF02的5倍，互補(bǔ)株BF02CΔlpfC的毒力部分恢復(fù)到野生株的水平。

3 討論

沙門菌菌毛結(jié)構(gòu)復(fù)雜，參與沙門菌對宿主細(xì)胞的粘附，與沙門菌的致病性密切相關(guān)。lpfABCDE是長極性菌毛操縱子，有研究顯示，LpfC蛋白參與LpfA菌毛亞單位的輸出和組裝，并且與沙門菌侵入派爾氏結(jié)及在其內(nèi)定植相關(guān)[10]。目前，關(guān)于丙型副傷寒沙門菌致病機(jī)理及其防控的研究還很少。

本研究采用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建丙型副傷寒沙門菌BF02的lpfC基因缺失株，可獲得無耐藥性基因缺失株，不會引起生物安全隱患。Red同源重組系統(tǒng)也不會對缺失基因的下游基因產(chǎn)生極性效應(yīng)，因此，該技術(shù)被廣泛用于大腸桿菌、沙門菌等細(xì)菌的基因缺失株構(gòu)建[12]。作為與沙門菌LPF菌毛合成相關(guān)的基因，生物學(xué)特性分析結(jié)果表明，lpfC基因的缺失不影響丙型副傷寒沙門菌的生長特性和生化特性，說明其對丙型副傷寒沙門菌的生長代謝沒有影響；在腸炎沙門菌中l(wèi)pfC基因缺失后，這些特性與我們的研究結(jié)果一致[13]。黏附侵襲試驗結(jié)果顯示，lpfC基因的缺失顯著降低了丙型副傷寒沙門菌對Caco-2細(xì)胞黏附侵襲能力，表明lpfC基因在丙型副傷寒沙門菌黏附及侵襲細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，lpfC基因的缺失顯著降低腸炎沙門菌對IPEC-J2的黏附能力，但對IPEC-J2的侵襲能力無明顯影響[14]，這與我們的研究結(jié)果不完全一致，具體原因有待于進(jìn)一步深入研究。毒力試驗結(jié)果顯示，lpfC基因缺失株的LD50是其親本野生株的5倍，說明lpfC基因的缺失會使丙型副傷寒沙門菌的毒力降低。腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌在缺失了lpfC基因后，缺失株的LD50分別是野生株的2倍和3倍[13,15]，說明lpfC基因的缺失同樣會引起腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的毒力降低，這與我們的研究結(jié)果一致，也說明lpfC基因與沙門菌毒力相關(guān)。

表2 野生株BF02、缺失株BF02ΔlpfC和互補(bǔ)株BF02CΔlpfC的LD50測定Table 2 LD50 of BF02, BF02ΔlpfC and BF02CΔlpfC

本研究成功構(gòu)建了丙型副傷寒沙門菌的lpfC基因缺失株，并分析了lpfC基因?qū)Ρ透眰抽T菌生物學(xué)特性和致病性的影響，為進(jìn)一步研究lpfC基因的功能及其在丙型副傷寒沙門菌致病過程中所起的作用奠定了基礎(chǔ)。