童志霞，李天森，李啟峰，丁金花，張 輝，陳創(chuàng)夫

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000）

布魯氏菌是引起家畜和野生動(dòng)物感染的胞內(nèi)革蘭氏陰性細(xì)菌病原體，其中B.abortus、B.melitensis和B.suis對(duì)人類健康影響最為顯著，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，尤其是在發(fā)展中國(guó)家[1]。布魯氏菌在宿主細(xì)胞中的存活及繁殖機(jī)理與幾種毒力因子密切相關(guān)：外膜蛋白、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）等[2]。布魯氏菌不具備經(jīng)典的LPS結(jié)構(gòu)，LPS通過(guò)改變細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子分泌、吞噬作用以及抗原遞呈，使布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)得以長(zhǎng)期存活和復(fù)制[3]。通過(guò)構(gòu)建基因缺失株證明，VirB蛋白是Ⅳ型分泌系統(tǒng)中重要的毒力因子，在侵入宿主巨噬細(xì)胞和胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4-5]。其中，VirB2和VirB5構(gòu)成的表面結(jié)構(gòu)與布魯氏菌的毒力及胞內(nèi)生存密切相關(guān)[6-7]。目前，對(duì)于布魯氏菌如何逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)，以及布魯氏菌侵入宿主細(xì)胞后如何改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境達(dá)到利于自身生存的研究，一直是國(guó)內(nèi)外布魯氏菌致病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。

SUMO化修飾和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）是細(xì)胞蛋白酶抑制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并且涉及減數(shù)分裂前期的各個(gè)方面[8]。與泛素途徑相類似，SUMO途徑也是由3個(gè)酶（E1、E2和E3）相繼參與完成[9]。在生物體中只發(fā)現(xiàn)1種E2結(jié)合酶：Ubc-9，它在SUMO化修飾介導(dǎo)的細(xì)胞通路中行使著重要功能[10]。有研究表明，Ubc-9對(duì)細(xì)胞增殖有顯著影響，如果Ubc-9功能缺失，就能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[11-12]。SUMO化系統(tǒng)可能有助于抵御微生物攻擊的內(nèi)在防御機(jī)制，但目前對(duì)于Brucella與SUMO化之間的關(guān)系尚不明確。

本研究以布魯氏菌LPS、Ⅳ型分泌系統(tǒng)VirB2缺失株侵染細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中類泛素SUMO-1的表達(dá)水平和偶聯(lián)酶Ubc-9的mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，初步探討布魯氏菌感染宿主細(xì)胞后影響類泛素表達(dá)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和菌株 布魯氏菌16M強(qiáng)毒株、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7由石河子大學(xué)人畜共患病實(shí)驗(yàn)室保存；布魯氏菌16M△VirB2缺失株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 試劑 SYBR Green熒光染料和八連管均購(gòu)自Roche公司；SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒、RNA提取試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物公司公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司；其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；兔抗SUMO-1單抗購(gòu)自Abcam公司；鼠抗兔HRP-IgG二抗購(gòu)自Bio-world公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 常規(guī)離心機(jī)為Thermo公司；全自動(dòng)高壓滅菌鍋為SANYO公司；高速冷凍離心機(jī)（centrifuge-5415D）為德國(guó)Eppendorf公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀為德國(guó)Roche公司；超凈工作臺(tái)（BHC-1300A/B3）；恒溫?fù)u床（HWY-100B）。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌16M強(qiáng)毒株、布魯氏菌16M△VirB2缺失株的培養(yǎng) 在生物安全柜中以1:1000的體積比接種布魯氏菌16M強(qiáng)毒株以及布魯氏菌16M△VirB2缺失株，于180 r/min、37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用接種環(huán)分別劃線接種至布魯氏菌固體培養(yǎng)基上，封口，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d。挑取單個(gè)菌落接種于20 mL布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，于37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)1～2 d，細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收菌。

1.2.2 布魯氏菌LPS的提取 85℃金屬浴滅活30 min，室溫收集2～5 mL，16 000×g離心2 min；加入1 mL細(xì)胞裂解液，充分渦旋混勻使之成為懸濁液，加入200 μL氯仿，劇烈渦旋10～20 s后室溫孵育5 min；用低溫離心機(jī)在4℃、16 000×g離心15 min，轉(zhuǎn)移400 μL上清液于新的1.5 mL離心管中；加入800 μL purification buffer充分混勻，于-20℃孵育10 min；4℃、16 000×g離心15 min，棄上清后獲得LPS顆粒；加入1 mL70%乙醇翻轉(zhuǎn)2～3次清洗LPS顆粒，再次4℃、16 000×g離心3 min，棄去乙醇溶液，室溫晾干殘留的LPS顆粒。加入30～50 μL10 mmol/L的Tris-HCl buffer（pH= 8.0）渦旋溶解LPS顆粒，100℃中煮沸2 min完全溶解LPS顆粒，瞬時(shí)離心，即得到純化的LPS。用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)LPS的濃度，將其保存于-20℃冰箱中。

1.2.3 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng) 將在液氮中凍存的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7取出，37℃恒溫水浴條件下迅速晃動(dòng)凍存管，直至細(xì)胞與凍存液變?yōu)橐后w；在超凈工作臺(tái)中將液體轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入4 mL DMEM培養(yǎng)液，封口后71×g離心5 min；棄上清，加入2 mL DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至6 cm培養(yǎng)板中，在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d；當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～100%時(shí)傳代至10 cm培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 布魯氏菌16 M脂多糖LPS對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞中類泛素SUMO-1和偶聯(lián)酶 Ubc-9 表達(dá)的影響 將小鼠巨噬細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔重新鋪板于六孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%，向六孔板中分別加入濃度為0.1、1、10 ng/mL的布魯氏菌16 M脂多糖LPS，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)孔，8字搖勻后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別在30 min、1 h、3 h時(shí)收集細(xì)胞，向六孔板中加入200 μL含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，使用移液槍反復(fù)吹打，直至細(xì)胞脫落；轉(zhuǎn)移液體至1.5 mL 無(wú)菌EP 管中，冰上裂解10 min，4℃、138 000×g離心10 min，收集上清，-80℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，其余六孔板用移液槍吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌2～3遍，然后向每孔中加入1 ml Trizol，移液槍反復(fù)吹打，充分裂解細(xì)胞，轉(zhuǎn)移液體于1.5 mL RNase-Free EP 管中，按照康為世紀(jì)超純RNA提取試劑盒說(shuō)明書獲得細(xì)胞 RNA。

1.2.5 布魯氏菌16M強(qiáng)毒株、布魯氏菌16M△VirB2缺失株侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 布魯氏菌16M、布魯氏菌16M△VirB2缺失株以侵染復(fù)數(shù)MOI=100:1進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn)：將收集的16M及16M△VirB2缺失株菌液用PBS洗滌2～3次后重懸混勻，與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷嶂了铦舛?，每孔加? mL比濁后的菌液輕搖混勻，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h；每孔加入2.5 μL硫酸慶大霉素孵育45 min以殺死胞外細(xì)菌，PBS清洗3次后更換為無(wú)抗性的DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在侵染后1、3、5 h收集細(xì)胞(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)類泛素SUMO-1/2/3和偶聯(lián)酶Ubc-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 根據(jù)康為超純RNA提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，用NanoDrop-2000c核酸蛋白微量定量?jī)x檢測(cè)濃度和純度，利用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20℃長(zhǎng)期保存。采用Roche LightCycler480?熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀，以不同時(shí)間段收集的細(xì)胞的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因，檢測(cè)類泛素SUMO-1/2/3和偶聯(lián)酶Ubc-9m RNA表達(dá)量，引物見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系（10 μL）：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL，目的基因類泛素SUMO-1/2/3和偶聯(lián)酶Ubc-9上、下游引物或內(nèi)參基因β、下游引物或上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL，cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s、60 ℃退火10 s、72℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。在同樣的條件下進(jìn)行3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

1.2.7 Western blot檢測(cè)類泛素SUMO-1蛋白表達(dá)量分別在細(xì)胞感染1、3、5 h時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后，每孔加入200 μL細(xì)胞裂解液和2 μL蛋白酶抑制劑PMSF，冰上裂解15 min；細(xì)胞刮刮取細(xì)胞重復(fù)孔合為1管，4℃、13 000×g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，以最小濃度為標(biāo)準(zhǔn)稀釋為統(tǒng)一濃度，加入5×蛋白示蹤上樣緩沖液100℃煮沸10 min，冷卻至室溫后取20 μL變性蛋白液于12%SDS-PAGE膠進(jìn)行垂直電泳檢測(cè)；將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，以兔抗類泛素SUMO-1為一抗（用TBST按照1:2500稀釋），37℃孵育1 h；鼠抗兔HRP-IgG為二抗（用TBST按照1:5000稀釋），37℃孵育1.5 h，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，DAB避光顯色后利用Quantity one 4.6.2軟件分析灰度值，目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比作為結(jié)果進(jìn)行比較。

表 1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primers for real-time quantitative PCR

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0軟件對(duì)qRT-PCR數(shù)據(jù)以及Quantity one 4.6.2軟件分析所得灰度值進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 布魯氏菌LPS對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞類泛素SUMO-1表達(dá)水平的影響吸取1 μL提純的脂多糖 LPS，NanoDrop 2000c 檢測(cè)脂多糖 LPS 的濃度，然后用無(wú)菌PBS稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖1A，布魯氏菌16M脂多糖LPS在任一濃度都并未引起小鼠巨噬細(xì)胞中SUMO-1表達(dá)的變化（圖1B）。

圖1 巨噬細(xì)胞中類泛素 SUMO-1 蛋白在不同濃度LPS刺激下不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平Fig.1 The expression levels of SUMO-1 protein in macrophages stimulated by different concentrations of LPS at different time

2.2 LPS刺激對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞中Ubc-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，各LPS刺激組與對(duì)照組相比，小鼠巨噬細(xì)胞中 Ubc-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平差異均不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.5）（圖2）。

2.3 布魯氏菌16M△VirB2缺失株對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞SUMO-1蛋白表達(dá)水平的影響通過(guò) Western blot檢測(cè)細(xì)胞中 SUMO-1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，布魯氏菌 16M△VirB2缺失株能夠改變細(xì)胞中 SUMO-1蛋白的表達(dá)（圖3A），與對(duì)照組相比，缺失株侵染組細(xì)胞中 SUMO-1 表達(dá)量顯著增加（圖3B），差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)。

2.4 布魯氏菌16M△VirB2缺失株對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞偶聯(lián)酶Ubc-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與布魯氏菌16M強(qiáng)毒株相比，布魯氏菌16M△VirB2缺失株組中Ubc-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)（圖4）。

圖2 巨噬細(xì)胞中Ubc-9 mRNA在不同濃度LPS刺激下不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平Fig 2 The transcription level of Ubc-9 mRNA in macrophages stimulated by different concentration of LPS at different time

圖 3 巨噬細(xì)胞中SUMO-V蛋白在16M、16M△VirB2缺失株侵染后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平Fig.3 The expression levels of SUMO-1 protein in Brucella 16M or 16M △VirB2-infected macrophages at different time

圖4 巨噬細(xì)胞中Ubc-9 mRNA在16M、16M△VirB2缺失株侵染不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 The transcription level of Ubc-9 mRNA in Brucella 16M or 16M△VirB2-infected macrophages at different time

3 討論

毒力布魯氏菌可以通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞凋亡，建立有利于其在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存活和復(fù)制的環(huán)境[13]。脂多糖對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性是至關(guān)重要的[14]。布魯桿菌LPS表現(xiàn)出與其他LPS不同的性質(zhì)。與經(jīng)典腸桿菌LPS相比，布魯桿菌LPS比大腸桿菌LPS活性低幾百倍且毒性小，在布魯氏菌的胞內(nèi)生存和復(fù)制中發(fā)揮重要作用[15]。研究表明，缺失布魯氏菌LPS的某一組分，布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存能力明顯減弱[14-15]。在細(xì)菌感染宿主細(xì)胞的致病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，致病菌會(huì)干擾類泛素化修飾過(guò)程中的某一環(huán)節(jié)，如李斯特桿菌的毒力因子融細(xì)胞素（Listeriolysin O，LLO），能夠降解關(guān)鍵偶聯(lián)酶 Ubc-9，從而干擾類泛素化修飾[16]。在志賀氏菌感染的情況下，一些被類泛素修飾的蛋白的定位發(fā)生了變化，且蛋白類泛素化修飾水平降低[17]。之前的研究同樣證實(shí)了布魯氏菌強(qiáng)毒株侵染細(xì)胞，可影響宿主細(xì)胞中類泛素化修飾相關(guān)蛋白表達(dá)的變化[18]。本研究通過(guò)不同濃度的布魯氏菌 16M 脂多糖 LPS 侵染小鼠巨噬細(xì)胞后，觀察到細(xì)胞中類泛素SUMO-1的表達(dá)水平和偶聯(lián)酶Ubc-9的mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平均未發(fā)生明顯變化。因此，我們認(rèn)為布魯氏菌毒力因子LPS對(duì)宿主類泛素化修飾相關(guān)蛋白表達(dá)的影響不顯著，布魯氏菌感染宿主細(xì)胞后影響類泛素表達(dá)的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

布魯氏菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)是一種由VirB1～VirB12編碼的多種蛋白復(fù)合物，主要向宿主細(xì)胞分泌毒力因子，與細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制有關(guān)[4]。在布魯氏菌眾多的VirB操縱子中，VirB2是表面蛋白，通過(guò)對(duì)VirB2進(jìn)行基因缺失研究發(fā)現(xiàn)，致病菌對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的持續(xù)感染能力顯著降低[19]。Hashemifar等[20]研究表明，VirB2和VirB5蛋白構(gòu)成布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)菌毛的重要組分，能夠通過(guò)結(jié)合特異性受體調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并且可以降解肽聚糖，在細(xì)胞壁上打孔并允許蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞。本研究通過(guò)缺失株布魯氏菌 16M△VirB2侵染小鼠巨噬細(xì)胞，不同侵染時(shí)間段檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞中類泛素SUMO-1的表達(dá)水平和偶聯(lián)酶Ubc-9的mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平的影響。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌VirB2缺失株侵染后的巨噬細(xì)胞SUMO-1表達(dá)及Ubc-9轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng)，與VirB2蛋白功能的研究結(jié)果一致。因此，本研究初步確定，布魯氏菌感染細(xì)胞過(guò)程中可能通過(guò)Ⅳ型分泌系統(tǒng)向宿主細(xì)胞中分泌效應(yīng)蛋白，或者是Ⅳ型分泌系統(tǒng)的組分蛋白直接與細(xì)胞中類泛素化修飾相關(guān)蛋白相互作用，從而干擾類泛素化修飾。

本研究初步確定布魯氏菌16M 脂多糖 LPS 對(duì)類泛素化修飾沒(méi)有影響，可能是通過(guò)布魯氏菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)或其自身組分蛋白影響類泛素SUMO-1的表達(dá)水平和偶聯(lián)酶Ubc-9的mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，從而在胞內(nèi)穩(wěn)定繁殖。