高 飛，姜一峰，李國新，張玉嬌，李麗薇，虞凌雪，周艷君，鄭海紅，童光志

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241，2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

豬瘟 （classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種急性、高度接觸性的致死性傳染病，是臨床上嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的一種傳染病，呈世界流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重[1-2]。近十幾年來，豬瘟仍在全國范圍內(nèi)流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國對(duì)于豬瘟的控制采取強(qiáng)制免疫策略。在全國范圍內(nèi)長時(shí)間高密度使用豬瘟疫苗，雖然控制了豬瘟的大面積流行與爆發(fā)，但參差不齊的免疫狀況和復(fù)雜的生物安全環(huán)境，使豬瘟病毒仍然在中國流行，并且不時(shí)有新的基因亞型出現(xiàn)。最近十年，2.1b亞型CSFV占主導(dǎo)地位[4-5]，2015年中國首次報(bào)道了2.1d亞型CSFV[6-8]。CSFV流行態(tài)勢(shì)日趨復(fù)雜，對(duì)豬瘟的檢測(cè)與控制絲毫不容放松。

CSFV屬于黃病毒科、瘟病毒屬，其基因組為長約12.3 kb的單股正鏈RNA，CSFV的囊膜糖蛋白E2是一種可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平中和抗體的重要保護(hù)性抗原[9-10]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR將常規(guī)PCR與熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，可應(yīng)用于臨床上高通量病原體的檢測(cè)[11-12]。本研究以CSFV E2基因的保守區(qū)域?yàn)榘行蛄?，設(shè)計(jì)并合成了一套特異性的引物和探針，建立了一種針對(duì)CSFV E2蛋白的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，為臨床上對(duì)豬瘟病毒的檢測(cè)和定量研究提供了重要的工具，也為本實(shí)驗(yàn)室研制的表達(dá)豬瘟病毒C株E2蛋白的PRRSV重組病毒vA-C-E2[14]后期在豬體內(nèi)的安全性分析和免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)等提供了一種定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 豬腎細(xì)胞系（PK-15）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬繁殖障礙綜合征創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（本實(shí)驗(yàn)室）保存；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）HuN4株（GenBank登錄號(hào)：EF635006）以及其細(xì)胞傳代致弱株vHuN4-F112、偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）JS-2012株、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus virus，PCV2）、豬瘟病毒石門株（GenBank登錄號(hào)：AF092448）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬瘟弱毒疫苗株HCLV（GenBank登錄號(hào)：AF091507）購自廣東永順生物制藥股份有限公司。

1.1.2 試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶購自NEB和TaKaRa公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自TIANGEN公司；RTPCR反轉(zhuǎn)錄酶為AMV，購自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒QIAprep Spin Miniprep Kit、RNA抽提試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit、DNA凝膠回收試劑盒均購自QIAGEN公司；pMD18-T載體克隆試劑盒、Premix Ex Taq、dNTP、DNA Marker等均購自TaKaRa公司；PCR儀（DNA Thermal Cycler480）為美國PERKIN ELMER公司產(chǎn)品；Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 核酸抽提 病毒RNA抽提按照QIAamp Viral RNA Mini Kit的說明書操作，最后用60 μL的去離子水溶解，-20℃保存。

1.2.2 引物和探針的設(shè)計(jì) 參照GenBank中CSFV（登錄號(hào)：AF092448、AF091507）E2基因序列，利用DNAStar Lasergene v7.1軟件進(jìn)行同源性分析，找出E2基因的保守區(qū)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)出一套特異性引物和TaqMan探針。上游引物E2-F：5'-CGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTAC-3'，下游引物E2-R：5'-CACGTCCAGGTCAAAC CAGTA-3'，探針E2-probe：5'-FAM-AGCCCA GGGACAGTTACTTCCAGCA-3'。探針的5'端選擇FAM作為報(bào)告基團(tuán)，3'端選擇BHQ1作淬滅基團(tuán)，擴(kuò)增目的片段長度為100 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，探針由上海吉瑪生物科技有限公司合成。針對(duì)PRRSV N蛋白的熒光定量PCR引物和探針：PNPF/PNPR/NP-probe參考文獻(xiàn)[13]。針對(duì)CSFV 5'UTR的熒光定量PCR引物和探針：P5UTRF/P5UTRR/ 5UTR-probe[15]由本團(tuán)隊(duì)保存。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以CSFV RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA 作為模板，使用上游引物E2-BZ-F：5'- CGGCTAGCC TGCAAGGAAGA-3'和下游引物E2-BZ-R：5'-AAATTCTGCGAAGTAATCTGAG-3'，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并回收，然后連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化，挑菌培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒。對(duì) PCR鑒定結(jié)果為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序和質(zhì)粒濃度測(cè)定，再將濃度換算為拷貝數(shù)，進(jìn)行10倍系列稀釋。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化及其特異性、敏感性和重復(fù)性檢測(cè) 對(duì)引物和探針的濃度采用矩陣法進(jìn)行優(yōu)化[16]。使用本研究中建立的熒光定量PCR方法對(duì)CSFV、PRV、PCV2、PRRSV的cDNA或者DNA進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較；另外對(duì)7個(gè)不同濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)Ct值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。

1.2.5 臨床樣品檢測(cè) 分別采集CSFV感染豬的血清、鼻拭子和肛拭子，使用本研究建立的針對(duì)CSFV E2基因的熒光定量PCR對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與常規(guī)PCR方法和針對(duì)CSFV 5' UTR的熒光定量PCR方法[15]檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.6 PRRSV重組病毒的檢測(cè) 前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了表達(dá)豬瘟病毒（C株）E2蛋白的PRRSV重組病毒vA-C-E2[14]，用本研究建立的檢測(cè)CSFV E2基因的熒光定量PCR方法和檢測(cè)PRRSV N基因的熒光定量PCR方法[13]對(duì)重組病毒vA-C-E2進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備以E2-BZ-F和E2-BZ-R為引物，CSFV RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約1000 bp，與預(yù)期大小一致?；厥誔CR產(chǎn)物并構(gòu)建重組質(zhì)粒pE2，測(cè)序結(jié)果顯示與目的片段序列完全一致。測(cè)定重組質(zhì)粒濃度后換算成拷貝數(shù)，進(jìn)行10倍系列稀釋至10 copies/μL，將準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)品于-20℃保存。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化通過對(duì)不同濃度的探針和引物進(jìn)行組合，經(jīng)過多次重復(fù)后，結(jié)果顯示當(dāng)探針濃度為0.2 pmol/μL，引物濃度為0.3 pmol/μL，退火溫度為60℃時(shí)，能夠獲得最低的Ct值和相對(duì)較高的熒光增加值。因此最優(yōu)反應(yīng)體系（20 μL）為：Premix Ex Taq10μL、上下游引物（10pmol/μL）各0.6μL、探針（10 pmol/μL）0.4 μL、模板2 μL、滅菌ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。

2.3 特異性試驗(yàn)使用優(yōu)化好的反應(yīng)體系對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的CSFV、PRV、PCV2、PRRSV和表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組PRRSV（vA-C-E2）等毒株同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示只有CSFV 和重組病毒vA-C-E2呈陽性，PRV、PCV2和PRRSV均無典型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照也未出現(xiàn)擴(kuò)增（圖1）。

2.4 敏感性試驗(yàn)使用優(yōu)化好的反應(yīng)體系對(duì)10倍系列稀釋的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示當(dāng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 copies/μL時(shí)Ct值仍然能夠檢出，因此本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法最低能夠檢測(cè)到10 copies/μL。與常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較，熒光定量PCR靈敏度比常規(guī)PCR高約100倍。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)使用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件對(duì)7個(gè)不同濃度（1×102copies/μL～1×108copies/μL）的陽性標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)3次，比較同一濃度不同重復(fù)的Ct值，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。結(jié)果顯示，該方法在1×102～1×108copies/μL范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.997。不同重復(fù)同一濃度的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差為0.018～0.220，變異系數(shù)為0.089%～0.750%，說明本研究建立的熒光定量PCR具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性（圖2）。

圖1 熒光定量PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The speci ficity of the fl uorescent quantitative PCR

圖2 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)敏感性分析Fig.2 Standard curve and the sensitivity analysis of the fl uorescent quantitative PCR

2.6 臨床樣品的檢測(cè)使用本研究建立的熒光定量PCR和常規(guī)PCR分別對(duì)CSFV感染豬場(chǎng)中的臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)。在20頭豬的血清、鼻拭子和肛拭子樣品中，普通PCR檢出10頭豬血清、鼻拭子和肛拭子均呈陽性的樣品。針對(duì)CSFV E2蛋白的熒光定量PCR檢出了所有普通PCR結(jié)果判斷為陽性的樣品，另有6份血清樣品、8份鼻拭子、6份肛拭子被普通PCR檢測(cè)為陰性，而本熒光定量方法檢測(cè)結(jié)果為陽性，說明本研究建立的熒光定量PCR檢測(cè)更加靈敏（表1）。在對(duì)豬瘟病毒RNA拷貝數(shù)的檢測(cè)中，與針對(duì)CSFV 5' UTR的熒光定量PCR方法相比，本研究建立的熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度相似。在檢測(cè)vA-C-E2病毒RNA拷貝數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，本研究建立的針對(duì)CSFV E2蛋白的熒光定量PCR與針對(duì)PRRSV N蛋白的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致，而針對(duì)CSFV 5' UTR的熒光定量PCR方法則未檢測(cè)到數(shù)值，符合預(yù)期（表2），說明此方法可以用于vA-C-E2疫苗候選株的檢測(cè)及與自然感染的鑒定診斷等。

3 討論

目前，對(duì)于CSFV的檢測(cè)主要利用免疫熒光、ELISA、RT-PCR等，但是這些方法分別存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，特異性敏感性低，容易出現(xiàn)污染，難以判斷結(jié)果等缺點(diǎn)，應(yīng)用存在一定的局限性。熒光定量PCR方法因其具有快速高效、特異靈敏、通量高等優(yōu)點(diǎn)，一直備受關(guān)注。熒光定量PCR分為相對(duì)定量（染料法）和絕對(duì)定量（探針法）兩種，本研究選擇CSFV的E2基因保守區(qū)序列來設(shè)計(jì)探針和引物，成功建立了一種可定量檢測(cè)CSFV的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法具有特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好，檢測(cè)時(shí)間短，速度快的優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法可用于CSFV毒株的檢測(cè)和定量，并且在檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組PRRSV疫苗候選株vA-C-E2中，與針對(duì)PRRSV N蛋白的熒光定量PCR方法的檢測(cè)靈敏度相似，可用于vA-C-E2的體外和體內(nèi)檢測(cè)。

表1 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果分析比較Table 1 Comparison of clinical samples detection using conventional PCR and RT-qPCR

表2 三種熒光定量PCR方法對(duì)vA-C-E2和CSFV石門株的檢測(cè)結(jié)果比較Table 2 Comparison of three qPCR methods for detecting vA-C-E2 and CSFV Shimen strain