左葉雯，孔 寧，李智麗，童 武，焦亞娟 ，王 樺 ，鄭 浩，高 飛，孫大格 ，于 海 ，李麗薇，虞凌雪，童光志，單同領(lǐng)

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.河南科技大學(xué)，洛陽 471023）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhoea virus，PEDV）為有囊膜單股正鏈RNA（singlestranded，ssRNA）病毒，屬于尼多病毒目、冠狀病毒科、α-冠狀病毒屬。PEDV主要引起豬的厭食、嘔吐、腹瀉、消化道粘膜發(fā)炎和糜爛等癥狀。近年來，變異型PEDV對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的影響，7日齡以內(nèi)仔豬感染后的發(fā)病率和死亡率高達(dá)100%。PEDV常和豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等其他腸道病毒混合感染，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大[1]。

病毒感染細(xì)胞后會引起細(xì)胞內(nèi)多種信號通路的變化，其中PI3K/AKT信號通路是調(diào)控病毒復(fù)制增殖的重要信號通路之一。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是PI3K/AKT信號通路下游的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有GSK-3α和GSK-3β兩種亞基[2]。GSK-3廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，它能夠通過磷酸化多種蛋白質(zhì)底物從而發(fā)揮各種不同的生物學(xué)功能。同時GSK-3 在 Wnt 、Hedgehog 等多種信號通路中均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，調(diào)控細(xì)胞的生長、代謝及細(xì)胞分化等[3]。在細(xì)胞未受到外界刺激時，基礎(chǔ)狀態(tài)下的GSK-3具有激酶活性。當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染等應(yīng)激后，能夠上調(diào)GSK-3的磷酸化水平，其中當(dāng)GSK-3α的Ser-21位點和GSK-3β的Ser-9位點的氨基酸殘基被磷酸化后，GSK-3的激酶活性被抑制；而GSK-3α的Tyr-279位點和GSK-3β的Tyr-216位點被磷酸化后，GSK-3的激酶活性維持并增強(qiáng)[4-5]。

β-catenin是GSK-3的下游底物，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞遷移和維持遺傳穩(wěn)定性等過程中均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。激活狀態(tài)下的GSK-3能夠?qū)ⅵ?catenin的Thr41、Ser37、Ser33位點依次磷酸化，磷酸化的β-catenin最后被細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白酶體系統(tǒng)所降解[6]。

目前對PEDV致病的分子機(jī)制尚缺乏深入研究，故只有進(jìn)一步深入探究PEDV與宿主之間的相互關(guān)系，才能對PEDV的致病機(jī)制有一個更深入的了解，從而為PEDV的防治與調(diào)控提供更好的策略，進(jìn)而減輕PED對豬群造成的危害。本研究主要通過探究GSK-3及β-catenin對PEDV復(fù)制的影響，挖掘二者之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步揭示PEDV的致病機(jī)制和宿主的抗病毒研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株和細(xì)胞變異PEDV強(qiáng)毒株JS-2013、Marc-145細(xì)胞均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬病毒性繁殖障礙綜合征團(tuán)隊（本實驗室）保存。

1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（FBS）均購自Gibco公司；蛋白酶抑制劑購自Biotool公司；CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司；5×蛋白上樣緩沖液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液、SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購自Thermo Fisher公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購自Whatman公司；DMSO、脫脂奶粉購自 Sigma-Aldrich 公司；QIAamp? Viral RNA 提取試劑盒購自Qiagen公司；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq?購自TaKaRa Bio公司；Salinomycin購自Selleckchem公司；P-GSK-3α/β（Tyr216/279）抗體、β-catenin抗體購自Abcam公司；P-GSK-3α/β（Ser21/9）抗體購自Cell Signaling Technology公司；PEDV N蛋白單克隆抗體由本實驗室保存。

1.3 PEDV感染Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長滿至單層后棄掉培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）漂洗細(xì)胞3次，吸凈殘余液體，加入1 MOI的 JS-2013 PEDV病毒液1 mL（含有一定濃度胰酶），以不接種病毒的細(xì)胞作為對照，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h（30 min左右時將細(xì)胞培養(yǎng)板晃勻1次）。用PBS漂洗細(xì)胞2次，吸凈殘余液體，加入含有胰酶的無血清的DMEM培養(yǎng)基2 mL，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 抑制劑毒性檢測使用CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay分別檢測抑制劑CHIR-99021、Salinomycin對Marc-145細(xì)胞的毒性。將Marc-145細(xì)胞鋪至96孔板，當(dāng)細(xì)胞長滿至單層后棄掉培養(yǎng)基，用PBS 洗滌2遍，每孔加入已用DMEM稀釋成不同濃度的抑制劑100 μL；同時以含有細(xì)胞、不加抑制劑的孔為細(xì)胞對照，并設(shè)置含有培養(yǎng)基但沒有細(xì)胞、不加抑制劑的孔為空白對照。每個樣品設(shè)置8個重復(fù)。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至所需時間，每孔加入20 μL的CellTiter 96? AQueous One Solution試劑，培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。酶標(biāo)儀測定OD490值，根據(jù)如下公式計算細(xì)胞活力：

細(xì)胞活力=（抑制劑處理組OD490值-空白對照組OD490值）/（細(xì)胞對照組OD490值-空白對照組OD490值）×100%

1.5 細(xì)胞抑制試驗用PBS漂洗Marc-145細(xì)胞2遍，加入CHIR-99021或Salinomycin的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用PEDV感染Marc-145細(xì)胞（具體方法見1.3），感染過程中加入同劑量的抑制劑。1 h后棄去病毒液，用PBS洗滌細(xì)胞2次后加入新鮮無血清培養(yǎng)基（含抑制劑及胰酶），同時用含相同濃度DMSO的無血清培養(yǎng)基作為陰性對照，培養(yǎng)至所需時間后分別收取細(xì)胞及上清。

1.6 實時熒光定量分析不同時間點收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，提取病毒RNA，具體操作步驟參考QIAamp?Viral RNA Mini Kit說明書進(jìn)行。用核酸蛋白濃度測定儀檢測所提RNA濃度。參照RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 μg RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄后所得到的cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex Taq?試劑盒配置熒光定量檢測體系，使用ABI 7500實時熒光定量儀進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，每組試驗做3個重復(fù)。采用Comparative delta-delta Ct法計算不同基因的mRNA表達(dá)量差異。

1.7 Western blot檢測將Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種PEDV（參照1.3）。棄去細(xì)胞上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入提前配置好的含有蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上靜置5～10 min；用細(xì)胞刮將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)板中刮下，收集到1.5 mL離心管中，用BCA Protein Assay Kit測定蛋白濃度；加入5×蛋白上樣緩沖液，在沸水中煮樣10 min使蛋白變性，保存于-20℃。根據(jù)TaKaRa Bio公司產(chǎn)品說明書配置10% 的SDS-PAGE凝膠，上樣時加入20 μg的總蛋白進(jìn)行凝膠電泳，待凝膠電泳結(jié)束后采用半干轉(zhuǎn)的方法，恒定電壓15 V，1 h將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上。轉(zhuǎn)膜完成后將NC膜放入5% 脫脂乳（脫脂奶粉溶解于TBST緩沖液）中室溫封閉1 h；用TBST緩沖液洗滌1次，加入一抗室溫孵育1 h；TBST 緩沖液漂洗3次，每次10 min，再加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h；TBST 緩沖液漂洗3次，每次10 min，避光加入SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物5 min后在暗室中進(jìn)行曝光顯影，顯影后將膠片晾干掃描并保存。

1.8 TCID50測定 將Vero細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，待細(xì)胞長滿后，用PBS洗滌3次，每孔加入10倍梯度稀釋的病毒液100 μL（每個梯度8孔重復(fù)），置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后補(bǔ)含有胰酶的無血清培養(yǎng)基100 μL。觀察并記錄陽性孔數(shù)，直至出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)不再增加為止。根據(jù)Reed-Muench算法計算半數(shù)組織感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）。

2 結(jié)果

2.1 抑制劑對細(xì)胞活性的影響為確定抑制劑的適宜濃度，采用CellTiter 96? AQueous One Solution試劑盒分別檢測2種不同抑制劑處理后Marc-145細(xì)胞的活性。使用的GSK-3特異性抑制劑CHIR-99021的終濃度分別為：0、5、10 μmol/L；Wnt經(jīng)典通路的特異性抑制劑Salinomycin的終濃度分別為：0、1、5、10 μmol/L。如圖1所示，隨著抑制劑濃度的升高，對細(xì)胞的毒性越來越大，抑制劑CHIR-99021終濃度為5 μmol/L時細(xì)胞活力為0.91，而終濃度為10 μmol/L時為0.81；Salinomycin的終濃度為1 μmol/L時細(xì)胞活力為0.98，5 μmol/L時為0.92，而10 μmol/L時細(xì)胞活力為0.85。我們最終選取CHIR-99021終濃度為5 μmol/L，Salinomycin終濃度為1 μmol/L進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖1 抑制劑CHIR-99021(A)和Salinomycin(B)對Marc-145細(xì)胞活性的影響Fig. 1 The effection of inhibitors CHIR-99021(A) and Salinomycin(B) on the cell viability of Marc-145 cells

2.2 GSK-3活性抑制后能夠抑制PEDV的增殖用5 μmol/L GSK-3特異性抑制劑CHIR-99021處理1 h后感染1 MOI的PEDV，觀察PEDV在Marc-145細(xì)胞內(nèi)的增殖情況。利用Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)的病毒含量發(fā)現(xiàn)，加入CHIR-99021抑制GSK-3活性后，細(xì)胞內(nèi)的病毒含量比不加抑制劑樣品中病毒含量低（圖2A）。這一結(jié)果與real-time PCR檢測細(xì)胞上清內(nèi)的病毒含量結(jié)果相一致（圖2B）。分別檢測12、16 h時的病毒TCID50的變化也與上述結(jié)果相一致（圖2C）。結(jié)果表明，GSK-3活性降低后能夠抑制PEDV的復(fù)制。

圖2 GSK-3活性抑制后能夠抑制PEDV在Marc-145細(xì)胞中的增殖Fig.2 Inhibition of PEDV replication in Marc-145 cells through inhibition of GSK-3 activity

2.3 病毒感染及GSK-3活性抑制后相關(guān)蛋白水平變化情況PEDV感染Marc-145細(xì)胞后，GSK-3-α/β在Ser21/9位點磷酸化水平增加，β-catenin含量增加，表明GSK-3活性降低，在12 h不明顯，16 h明顯（圖3）。用終濃度5 μmol/L的抑制劑CHIR-99021在Marc-145細(xì)胞上抑制GSK-3活性1 h后感染PEDV，檢測結(jié)果顯示，用抑制劑CHIR-99021抑制GSK-3的活性后，GSK-3-α/β在Tyr279/216位點磷酸化水平明顯降低，而在Ser21/9位點磷酸化水平變化不明顯，β-catenin的蛋白含量增加，且PEDV的含量降低（圖3）。研究結(jié)果表明，在Marc-145細(xì)胞上抑制GSK-3的活性后，β-catenin含量增加。

2.4 抑制Wnt/β-catenin通路后對PEDV復(fù)制的影響β-catenin是Wnt經(jīng)典通路中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，用特異性抑制劑Salinomycin 抑制Wnt/β-catenin通路1 h后接種PEDV，16 h后收取上清及細(xì)胞樣品。Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)的病毒含量發(fā)現(xiàn)，加入Salinomycin 后，β-catenin含量降低，細(xì)胞內(nèi)的病毒含量比不加抑制劑樣品中病毒含量低（圖4A）。這一結(jié)果與real-time PCR及TCID50檢測細(xì)胞上清中病毒含量的結(jié)果相一致（圖4B、4C）。

3 討論

近年來，變異型PEDV傳播速度快，范圍廣，各年齡段豬均易感，對小豬的影響尤其嚴(yán)重，7日齡仔豬感染后的死亡率達(dá)到100%，給世界各國的養(yǎng)豬業(yè)均造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。進(jìn)一步探究PEDV與宿主之間的相互關(guān)系，可以更深入了解PEDV的致病機(jī)制。GSK-3是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶，除了具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)糖代謝，細(xì)胞運(yùn)動、凋亡，細(xì)胞分化、增殖和胚胎發(fā)育等生物學(xué)功能外，同時在病毒復(fù)制過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。Khan等[7]研究發(fā)現(xiàn)，用仙臺病毒感染成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)GSK-3被激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游分子β-catenin 在S33/S37/T41位點發(fā)生磷酸化，從而激活I(lǐng)RF3調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在抗病毒天然免疫中發(fā)揮重要作用。Lei等[8]研究表明，GSK-3β能夠促進(jìn)TBK1發(fā)生二聚化或低聚化及Ser172位點的自磷酸化，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3，誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。GSK-3在調(diào)節(jié)冠狀病毒N蛋白磷酸化方面也發(fā)揮重要作用。Wu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，用抑制劑抑制GSK-3磷酸化后，可降低嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SCoV）N蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制病毒在Vero E6 細(xì)胞上的復(fù)制。

圖3 PEDV感染Marc-145細(xì)胞及抑制GSK-3活性后GSK-3磷酸化及β-catenin的變化情況Fig. 3 The variation of phosphorylation of GSK-3 and β-catenin after PEDV infection and treated with CHIR-99021 in Marc-145 cells

圖4 抑制β-catenin可促進(jìn)PEDV在Marc-145細(xì)胞上的增殖Fig.4 Promotion of PEDV replication in Marc-145 cells through inhibition of β-catenin

β-catenin是GSK-3信號通路下游的一個重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。Lu等[10]2011年研究發(fā)現(xiàn)Salinomycin能夠通過阻斷Wnt輔助性受體LRP6（lipoprotein receptor related protein 6）的磷酸化，促使LRP6蛋白降解從而阻斷Wnt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制下游LEF1、cyclin D1、fibronectin等基因的表達(dá)，誘導(dǎo)CLL細(xì)胞（chronic lymphocytic leukemia cells）的凋亡。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)，病毒在感染宿主細(xì)胞后能激活Wnt/β-catenin信號通路，使β-catenin的含量增加，從而對病毒的復(fù)制增殖過程產(chǎn)生影響。Zhu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，用小分子抑制劑（ICRT 14）抑制 β-catenin的含量后，可顯著降低牛皰疹I(lǐng)型病毒（Bovine herpesvirus type 1，BoHV-1）在產(chǎn)毒期的病毒水平，表明 β-catenin能夠促進(jìn)BoHV-1在非神經(jīng)元細(xì)胞上的復(fù)制。Harmon等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路激活后能夠促進(jìn)裂谷熱病毒（Rift valley fever virus, RVFV）在細(xì)胞上的復(fù)制。而在甲型流感病毒感染肺泡上皮細(xì)胞后，β-catenin能夠通過增強(qiáng)病毒依賴IFNB1基因和干擾素刺激基因的表達(dá)，抑制甲型流感病毒在肺泡上皮細(xì)胞上的復(fù)制，從而抑制病毒復(fù)制；同時流感病毒RNA通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的RIG-I/NF-κB信號通路來抑制β-catenin依賴的轉(zhuǎn)錄，抵消β-catenin的抗病毒效果[13]。Hao等[14]的研究結(jié)果表明，LiCl 能夠通過激活Wnt/β-catenin通路和抑制促炎癥反應(yīng)，抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）在Marc-145 和PAM-CD163 細(xì)胞上的復(fù)制。

為探究GSK-3能否對PEDV的復(fù)制過程產(chǎn)生影響，本研究在Marc-145細(xì)胞上感染PEDV，采用Western blot方法檢測相關(guān)蛋白水平的變化。檢測結(jié)果顯示，PEDV感染Marc-145細(xì)胞后，GSK-3α/β（Ser21/9）磷酸化蛋白水平增加，同時，β-catenin含量增加，表明GSK-3的活性受到抑制。通過在Marc-145細(xì)胞上抑制GSK-3的活性后感染PEDV，研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3活性被抑制后，β-catenin含量的增加抑制了PEDV的增殖。β-catenin是GSK-3的底物之一，同時是Wnt經(jīng)典通路中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它在病毒的復(fù)制增殖過程中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。為探究GSK-3是否通過調(diào)控下游β-catenin的變化影響PEDV的增殖，試驗進(jìn)一步在Marc-145細(xì)胞上抑制Wnt/β-catenin通路后感染PEDV。檢測結(jié)果表明，β-catenin含量降低后促進(jìn)了PEDV的增殖。上述結(jié)果表明，PEDV感染Marc-145細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)GSK-3的活性降低，β-catenin的表達(dá)量增加能夠抑制PEDV的增殖。本研究結(jié)果為后期深入探索PEDV的致病機(jī)制與宿主的抗病毒反應(yīng)提供了一定理論基礎(chǔ)。