陳俊，袁保東，彭孝紅，姚芳，李佺，陳國璽，蘭星

(武漢市肺科醫(yī)院，武漢 430030)

近年來全世界結核疫情嚴重，結核感染率及發(fā)病率均升高。2015年全球新增結核患者約10 400萬，約1 800萬例患者死亡，我國為全球新發(fā)結核病例最多的6個國家之一。氣管支氣管結核(TBTB)是結核病中危害最大、傳染性最強、肺功能損害最重的一類結核病。TBTB治療困難、療程長，部分患者甚至出現(xiàn)耐藥、結核復發(fā)、肺功能嚴重受損等。所以優(yōu)化TBTB治療方案并減少后遺癥是結核治療中的重點和難點。氣道內免疫治療可能成為新的突破點。有報道提出免疫因子TNF-α、IFN-γ、IL-6可作為結核感染后的有效生物標志物[1～3]，在對結核分枝桿菌(簡稱Mtb)的免疫應答中扮演著重要角色。本文通過檢測TBTB患者支氣管灌洗液中細胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6)水平，分析它們在TBTB發(fā)病及轉歸中的變化，探討這些細胞因子在TBTB病程中所起到的免疫調節(jié)作用及意義，為TBTB的氣道內免疫治療提供理論依據(jù),進一步優(yōu)化TBTB治療方案。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 TBTB組 選取我院2016年1～12月明確診斷的40例TBTB住院患者作為TBTB組。TBTB組男22例、女18例，年齡(36.75±12.45)歲，吸煙11例，有既往病史12例(糖尿病4例、慢性胃炎2例、乙肝病毒攜帶2例、胃大部切除1例、慢性咽炎1例、合并小兒麻痹癥后遺癥1例、有肺結核病史者1例)。TBTB診斷依據(jù)2012年氣管支氣管結核診斷和治療指南[4]。納入標準：所有TBTB患者治療前痰結核菌涂片(STB)、痰結核菌培養(yǎng)(人型分枝桿菌，CTB)均陽性，CTB藥敏無耐藥，纖維支氣管鏡(簡稱纖支鏡)檢查提示氣管、支氣管結核(病變累及主支氣管、葉、段支氣管，部分患者病變累及主氣管)，灌洗液普通細菌培養(yǎng)、霉菌涂片和培養(yǎng)均陰性，血清降鈣素(PCT)正常。TBTB組患者接受抗結核治療及異煙肼聯(lián)合地塞米松霧化吸入治療。所有患者定期隨訪，治療2月末患者痰STB均轉陰，纖支鏡檢查提示氣管、支氣管病變明顯好轉，肺部影像學較前吸收。治療前及治療1、2、6月，纖支鏡檢查時留取支氣管灌洗液。

1.1.2 菌陰組 選取同期住院診斷為菌陰肺結核患者40例(均為健康體檢時發(fā)現(xiàn))作為菌陰組。菌陰組男21例、女19例，年齡(34.13±11.42)歲，吸煙13例，有既往病史6例(糖尿病3例、慢性胃炎1例、乙肝病毒攜帶2例)。入選標準：3次STB及1次CTB均陰性，常規(guī)抗感染治療無效，臨床排除其他非結核性肺部疾患。胸部CT檢查符合典型結核影像學特征(經(jīng)兩位胸科影像學專家共同閱片證實)。結核菌素試驗(+++～++++)，T-spot陽性。纖支鏡檢查證實氣道無明顯異常(經(jīng)兩位纖支鏡專職醫(yī)生認同)，選取病灶相應肺段行支氣管灌洗留取標本。受試者1個月內無明顯呼吸道感染史,既往無心肺疾病和過敏性疾病史，纖支鏡灌洗液普通細菌培養(yǎng)、霉菌涂片和培養(yǎng)均陰性，PCT正常。菌陰組患者接受診斷性抗結核治療并隨訪觀察，抗結核治療2月，肺部影像學較前吸收好轉，診斷性治療有效。

1.1.3 對照組 選取同期住院行纖支鏡檢查的縱隔淋巴結結核患者8例、可疑縱隔腫瘤2例為對照組。對照組男6例、女4例，年齡(42.40±13.08)歲，吸煙5例，有既往病史4例(乙肝病毒攜帶2例、糖尿病1例、白細胞減少1例)。入選標準：胸部CT檢查肺部無實質性病變(經(jīng)兩位胸科影像學專家共同閱片證實)，纖支鏡檢查證實氣道無明顯異常(經(jīng)兩位纖支鏡專職醫(yī)生認同)；受試者術前1個月內無呼吸道感染史,既往無心肺疾病和過敏性疾病史；纖支鏡灌洗液普通細菌培養(yǎng)、霉菌涂片和培養(yǎng)均陰性，PCT正常；3次STB及1次CTB均陰性。纖支鏡檢查時選取同一肺段(右上支氣管)行支氣管灌洗留取標本。

三組性別、年齡、吸煙比例、有既往史比例比較P均>0.05。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批，患者知情同意。

1.2 支氣管灌洗液TNF-α、INF-γ、IL-6檢測 各組纖支鏡檢查時，每次灌洗10 mL(生理鹽水)，共3次，盡量回抽灌洗液留取標本，低溫離心(2 000 r/min)，留取上清，置-80 ℃冰箱保存待測。采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6、INF-γ，試劑均購自上海滬鼎生物科技有限公司,按說明書操作。

2 結果

TBTB組治療前后及菌陰組、對照組支氣管灌洗液TNF-α、INF-γ、IL-6水平比較見表1。

3 討論

TBTB是發(fā)生在氣管、支氣管黏膜、黏膜下層平滑肌、軟骨及外膜的結核病[4]，屬于下呼吸道結核病，嚴重影響氣道結構及功能。

表1 TBTB組治療前后及菌陰組、對照組支氣管灌洗液

注：與菌陰組及對照組相比，*P<0.05；與本組治療前相比，△P<0.05；與本組治療1月相比，○P<0.05；與本組治療2月相比，●P<0.05。

在TBTB發(fā)生發(fā)展過程中，有多種細胞因子參與了氣道內的免疫應答及其病理過程。有研究[2,3,5]發(fā)現(xiàn)，在結核患者的血清、胸腔積液以及實驗動物的支氣管肺泡灌洗液中均可檢測出TNF-α、IFN-γ、IL-6，提出這些因子可作為結核感染后的有效生物標志物。預防結核感染的AERAS-402氣溶膠疫苗接種引起恒河猴強大的細胞免疫應答，在實驗動物肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)特異性CD4及CD8效應性T細胞，并產生大量細胞因子，如IFN-γ、TNF-α等[6]。但目前國內外尚無TBTB患者支氣管灌洗液中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平研究的報道。

TNF-α是一類由激活的巨噬細胞、淋巴細胞等所分泌的細胞因子，有廣泛的生物學活性，能促進巨噬細胞的吞噬功能并有利于清除胞內Mtb，促進機體產生有效的肉芽腫應答。Dorhoi等[7]發(fā)現(xiàn)，超高水平的TNF-α與結核病變加重相關，所以TNF-α起到保護性免疫和致炎的雙重作用，TNF-α表達的波動可以明顯影響疾病的病程。TNF-α亦可誘導內皮細胞和巨噬細胞釋放IL-6，并調控早期IL-6的產生[8]，形成因子之間相互促進、復雜的協(xié)同作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TBTB組治療前支氣管灌洗液中TNF-α較菌陰組、對照組明顯升高，TNF-α產生增多有利于激活多種免疫細胞及因子，促進機體清除結核感染。Navarra等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在亞洲結核病流行地區(qū)，接受TNF-α拮抗劑治療的患者結核患病風險增加。TBTB組患者治療2月時氣管、支氣管病變明顯好轉，肺部影像學較前吸收，TNF-α檢測值下降，與疾病恢復一致。Shameem等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在耐多藥肺結核(MDR-TB)患者中，血清TNF-α水平明顯高于其他結核病患者，建議將TNF-α作為MDR-TB患者對二線抗結核藥物治療有效的指標。因本文未納入MDR-TB患者，若支氣管灌洗液中TNF-α持續(xù)升高，我們是否需要警惕MDR-TB可能，有待進一步的研究。

IFN-γ主要由活化的Th1細胞產生，它可以促進巨噬細胞活化、清除胞內Mtb,提高組織相容性復合物Ⅱ(MHC-Ⅱ)分子表達，促進抗原識別[11]。IFN-γ水平的高低可區(qū)分活動性和潛伏結核感染[12]。目前廣泛開展的t-spot檢測技術，可檢測血清IFN-γ水平用于診斷結核病。本研究發(fā)現(xiàn)TBTB組治療前支氣管灌洗液中IFN-γ水平較菌陰組、對照組明顯升高，提示IFN-γ升高與氣道內結核感染相關。Adewole等[13]隨訪監(jiān)測活動性肺結核患者在治療前3月血清IFN-γ水平，發(fā)現(xiàn)治療1月時較治療前水平升高，治療3月時血清IFN-γ明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)在治療1月時，TBTB組支氣管灌洗液中IFN-γ較治療前輕度升高，但差異無統(tǒng)計學意義，分析原因可能為有效的抗結核治療導致Mtb大量死亡，死亡菌體抗原刺激淋巴細胞導致肺組織T淋巴細胞產生增加；其次為部分患者支氣管結核較重，病初干酪壞死物堵塞氣道，當支氣管逐步通暢，灌洗液中IFN-γ檢測值較前升高。隨著病情好轉恢復，患者于治療2月IFN-γ水平明顯下降，治療6月時與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

IL-6在炎癥及免疫反應中起到多效應性作用，并促進結核感染后有效的宿主免疫反應。其作用機制為促進T、B細胞成熟，介導急性炎癥反應。Lopes等[14]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6能刺激早期IFN-γ的產生,IL-6基因敲除小鼠IFN-γ產生低，提示IL-6在對Mtb的保護性反應中起關鍵作用。IL-6水平升高可增強組織細胞對TNF-α的敏感性。而另一方面，IL-6又可下調巨噬細胞殺微生物活性，抑制INF-α的產生，由Mtb感染的巨噬細胞分泌的IL-6可抑制未感染的巨噬細胞對IFN-γ的反應[15]。有研究表明，IL-6可能發(fā)揮多重效應，并對宿主控制Mtb感染產生影響。本文發(fā)現(xiàn)TBTB組治療前支氣管灌洗液IL-6水平明顯高于菌陰組、對照組，但治療1月后較治療前明顯下降，早于TNF-α、IFN-γ，考慮可能與IL-6免疫調節(jié)的雙向性和復雜性相關，若IL-6水平持續(xù)升高，反而抑制受Mtb感染的巨噬細胞中IFN-γ誘導的自噬功能[16]，不利于炎癥恢復，可導致組織壞死加重及MDR-TB。TBTB組患者治療2月及治療6月支氣管灌洗液IL-6水平與菌陰組、對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。Fatima等[17]研究發(fā)現(xiàn)，活動性肺結核和MDR-TB患者血清IL-6明顯高于接受抗結核治療的患者。本研究TBTB組患者抗結核治療后支氣管灌洗液IL-6水平也明顯下降。

本研究不足之處：因均為痰菌陽性的支氣管結核患者，支氣管肺泡灌洗治療有導致Mtb播散、病灶增多的風險，故纖支鏡治療留取標本均采用支氣管灌洗，灌洗后盡量回抽留取標本，以免灌洗液流入其他葉段支氣管導致細菌播散。其次需進一步探討免疫細胞和細胞因子復雜的網(wǎng)絡聯(lián)系，更深層次了解免疫狀況及機制。