胡貴麗 劉 靖 田 莎 宋澤和 范志勇 張石蕊 賀 喜

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，飼料安全與高效利用教育部工程研究中心，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128)

在現(xiàn)代規(guī)模化養(yǎng)殖生產(chǎn)中，為了促進(jìn)動物的快速生長，防治動物疾病，抗生素在畜禽生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，甚至濫用?？股厥褂脦淼目股貧埩簟⒓?xì)菌耐藥性等問題，給人類的生存環(huán)境和身體健康帶來了巨大的威脅。鑒于濫用抗生素造成的危機，許多國家和地區(qū)都禁止或限制在飼料中添加抗生素。因此，開發(fā)綠色、高效、無污染的安全飼料添加劑成為當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的必然趨勢。

植物提取物具有綠色、無污染、低毒、易降解等特點，是一類最常用且具有巨大潛力的抗生素替代物，近年來得到了廣泛的研究和應(yīng)用。博落回生物堿具有較強的抗菌消炎作用[1]；而多糖能夠促進(jìn)自由基的清除，對動物機體的特異性免疫、非特異性免疫以及細(xì)胞免疫、體液免疫均有重要影響[2]。研究發(fā)現(xiàn)，博落回血根堿能抑制植物性細(xì)菌、霉菌和病毒的增殖[3]。郁建生[4]報道，博落回注射液對禽巴氏桿菌、大腸桿菌和雞白痢沙門氏菌具有較好的抑菌效果，對禽霍亂和仔豬白痢亦具有較好的治療效果。孫波等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加黃芪多糖能降低49日齡肉雞盲腸中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，增加乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量。但是，目前關(guān)于茶籽多糖和博落回生物堿對畜禽特別是肉雞腸道健康的研究較少。因此，本試驗旨在研究茶籽多糖和博落回生物堿對黃羽肉雞腸道健康的影響及博落回血根堿的抑菌效果和最低抑菌濃度(MIC)，為茶籽多糖和博落回生物堿在畜禽腸道健康上的研究及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

博落回生物堿：總堿含量為70%，其中血根堿占60%，白屈菜紅堿占20%，由湖南中藥提取工程研究中心提供；茶籽多糖：純度為43.4%，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院油脂教研室提供；博落回血根堿：純度約為40%，用20%甲醇配制濃度為9.6 mg/mL的溶液，由湖南中藥提取工程研究中心提供；抗生素：前期為抗敵素，后期為黃霉素；青霉素鈉：純度為95%，用20%甲醇配制濃度為4.8 mg/mL的溶液。

試驗菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)BNCC186335、大腸桿菌(Escherichiacoil)BNCC336953、沙門氏菌(Salmonellaparatyphiβ)BNCC103169、巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)BNCC126487，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 飼養(yǎng)試驗

選擇同批次、遺傳背景相同、發(fā)育正常的1日齡黃羽肉雞750羽，隨機分為5個組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)25只雞。各組雞的初始體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。采用單因子隨機試驗設(shè)計，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加抗生素(1～28日齡為10 mg/kg抗敵素，29～56日齡為5 mg/kg黃霉素；抗生素組)、茶籽多糖(0.04%；多糖組)、博落回生物堿(1～28日齡為10 mg/kg，29～56日齡為20 mg/kg；博落回組)、茶籽多糖(0.04%)+博落回生物堿(1～28日齡為10 mg/kg，29～56日齡為20 mg/kg；多糖+博落回組)。抗生素的添加符合我國現(xiàn)行法律法規(guī)規(guī)定。試驗雞采用粉料飼喂。試驗期56 d。

1.2.2 抑菌試驗

將已活化的4種細(xì)菌菌種分別接種于試管斜面培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，滅菌前調(diào)pH為7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min)，置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)挑取一環(huán)菌體放入裝有玻璃珠的生理鹽水中，充分振搖，用血球記數(shù)板記數(shù)，調(diào)至107～108個/mL。

1.3 試驗飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1994)和《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)中的肉雞營養(yǎng)需要，選用玉米、豆粕等原料配制而成，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of diets：Cu 25 mg，F(xiàn)e 96 mg，Mn 105.4 mg，Zn 98 mg，Na 0.9 mg，VA 12 000 IU，VD32 500 IU，VE 20 mg，VK33.0 mg，VB13.0 mg，VB28.0 mg，VB67.0 mg，VB120.03 mg，泛酸 pantothenic acid 20.0 mg，煙酸 niacin 50.0 mg，生物素 biotin 0.1 mg，葉酸 folic acid 1.5 mg。2)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗雞舍選用開放式，采用高低床平養(yǎng)，光照為14 h光明：10 h黑暗(14 L:10 D)；1～7日齡30～33 ℃、8～14日齡27～29 ℃、15～21日齡24～26 ℃、22～28日齡22～23 ℃、29～56日齡20～21 ℃，保持正常溫度，舍內(nèi)采取鍋爐控溫，自然通風(fēng)。定期打掃雞舍衛(wèi)生，相對濕度保持在55%～65%，自由飲水和采食，按常規(guī)程序免疫。

1.5 樣品采集

于56日齡早晨，分別從每個重復(fù)中選擇1只接近該組平均體重的試驗雞，屠宰后取空腸內(nèi)容物1 g，用于腸道微生物的測定；取2段2 cm長的空腸組織，用10%甲醛溶液固定，用于腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的測定。

1.6 測定指標(biāo)與方法

1.6.1 空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)

將固定的標(biāo)本經(jīng)脫水→透明→浸蠟→包埋→修塊→切片→展片→常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色等處理后，制成石蠟切片；之后用100倍光鏡(Motic AE67)隨機選擇多個非連續(xù)性視野觀察切片，并挑選典型視野拍攝成圖片，用DT2000通用圖像分析軟件2.0進(jìn)行觀察測量，測定空腸絨毛高度、隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.6.2 空腸內(nèi)容物中大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量

在無菌操作臺中稱取0.5 g左右的空腸內(nèi)容物置于無菌試管中，加入無菌稀釋液(生理鹽水)4.5 mL，在磁力振蕩器上振蕩3～5 min，此液為10-1倍稀釋液；離心后吸取上清液0.5 mL加入盛有4.5 mL無菌稀釋液的另一個試管中進(jìn)行10-2倍稀釋；然后繼續(xù)用無菌稀釋液進(jìn)行系列稀釋(10-3～10-5)。分別從10-3、10-4、10-5倍稀釋溶液中取0.1 mL接種到各培養(yǎng)基上，用涂布棒進(jìn)行涂板。大腸桿菌采用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)培養(yǎng)，37 ℃有氧培養(yǎng)24 h后計數(shù)；乳酸桿菌采用乳酸桿菌培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)培養(yǎng)，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后計數(shù)。樣品菌落數(shù)計算公式如下：

菌落數(shù)(個)=lg{[菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×(5 mL/0.1 mL)]/0.5 g}。

1.6.3 抑菌活性

抑菌活性定性試驗：采用瓊脂擴(kuò)散紙片法測定。倒好平板后，用滅菌棉簽沾取菌懸液，涂滿整個平板，倒置，干20 min；用鑷子夾取濾紙片(己干熱滅菌、直徑7 mm)在待測液中浸濕，吸去多余的液體，順次放在含菌平板上，每個平板各種待測物濾紙片各1片，20%甲醇溶劑對照濾紙片1片；細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測定平皿內(nèi)抑菌圈直徑(D)，重復(fù)4次。抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：D≤8 mm為不敏感；818 mm為高度敏感。

MIC測定：采用試管液體二倍稀釋法進(jìn)行測定。將藥液試管進(jìn)行2倍稀釋至第24管，每管加入菌液使其濃度為105CFU/mL，同時平行進(jìn)行前23管陰性和第24管陽性對照。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，以目測法和對照組比較法判斷結(jié)果，以完全無細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為細(xì)菌對該藥物的敏感度，即為該藥物MIC。相同過程重復(fù)3次，求平均值。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 16.0軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行系統(tǒng)分析，組間差異顯著者則采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)

由表2可知，與對照組和抗生素組相比，多糖組、博落回組和多糖+博落回組黃羽肉雞的空腸絨毛高度和隱窩深度無顯著差異(P>0.05)。多糖組、博落回組和多糖+博落回組的空腸V/C顯著高于對照組(P<0.05)，與抗生素組無顯著差異(P>0.05)；空腸V/C在多糖組、博落回組和多糖+博落回組之間無顯著差異(P>0.05)。

2.2 空腸內(nèi)容物中大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量

由表3可知，多糖組、博落回組和多糖+博落回組黃羽肉雞的空腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量與對照組和抗生素組相比無顯著差異(P>0.05)，但均低于對照組。與對照組和抗生素組相比，多糖組、博落回組和多糖+博落回組的空腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量極顯著升高(P<0.01)，但多糖組、博落回組和多糖+博落回組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 茶籽多糖和博落回生物堿對黃羽肉雞空腸絨毛高度和隱窩深度的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。In the same column, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

表3 茶籽多糖和博落回生物堿對黃羽肉雞空腸內(nèi)容物中大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的影響

2.3 博落回血根堿的抑菌效果

由表4可知，博落回血根堿對4種試驗菌株的抑菌圈直徑分別為14、13、22和18 mm。結(jié)果表明，博落回血根堿對金黃色葡萄球菌和巴氏桿菌中度敏感，對大腸桿菌低度敏感，對沙門氏菌高度敏感。與青霉素鈉相比，博落回血根堿除對巴氏桿菌的抑菌效果較弱之外，對其他3種試驗菌株的抑菌效果都有不同程度的增強，特別是沙門氏菌。

表4 博落回血根堿對試驗菌株的抑菌圈直徑

2.4 博落回血根堿的MIC

由表5可知，博落回血根堿對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC均為25.00 μg/mL，對巴氏桿菌的MIC為12.50 μg/mL，對沙門氏菌的MIC為1.56 μg/mL，說明博落回血根堿對沙門氏菌的抑菌效果較好。與青霉素鈉相比，博落回血根堿對金黃色葡萄球菌和巴氏桿菌的MIC較高。

表5 博落回血根堿對試驗菌株的MIC

3 討 論

3.1 茶籽多糖和博落回生物堿對黃羽肉雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

小腸絨毛高度和隱窩深度與腸道的消化吸收功能密切相關(guān)，小腸發(fā)育越完善，對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收就越好[6]。絨毛高度增加，密度增大，成熟的上皮細(xì)胞增多，小腸的吸收面積增大，吸收能力增強[7]。隱窩變淺，腸上皮細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強[8]。V/C綜合反映小腸功能狀況，比值上升，腸道黏膜結(jié)構(gòu)改善，消化吸收能力增強。戴波[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5和1.0 mg/kg血根堿能預(yù)防和治療仔豬腹瀉。博落回生物堿中血根堿具有抗菌和抗炎作用，腸道絨毛受損時能直接作用于絨毛并修復(fù)絨毛，從而調(diào)節(jié)腸道健康[10]。本試驗結(jié)果顯示，各組黃羽肉雞的空腸絨毛高度和隱窩深度無顯著差異；多糖組、博落回組和多糖+博落回組的空腸V/C顯著高于對照組，與抗生素組無顯著差異。這表明飼糧中添加茶籽多糖和博落回生物堿改善空腸黏膜結(jié)構(gòu)的作用與抗生素相當(dāng)，可以有效促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而提高動物的生產(chǎn)效率，而茶籽多糖和博落回生物堿的聯(lián)合使用與單獨添加效果一致。

3.2 茶籽多糖和博落回生物堿對黃羽肉雞空腸內(nèi)容物中大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的影響

微生物、動物機體和環(huán)境是一種相互依存的關(guān)系，微生態(tài)平衡狀態(tài)下，腸道中正常的微生物菌群能改善腸道結(jié)構(gòu)和功能，增強腸道免疫功能和抵抗疾病能力[11]。腸道微生物菌群可為重要的淋巴細(xì)胞亞群的發(fā)育提供信號，維護(hù)腸道T、B細(xì)胞的發(fā)育；也可以通過影響輔助性T細(xì)胞1(Th1)和輔助性T細(xì)胞2(Th2)效應(yīng)細(xì)胞比率進(jìn)而影響全身性免疫應(yīng)答[12]。外源性添加物質(zhì)可以改變腸道微生物的組成。Lee等[13]研究顯示，飼糧中添加20 mg/kg血根堿能顯著提高肉雞盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加茶籽多糖和博落回生物堿對黃羽肉雞空腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量無顯著影響，但極顯著提高空腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量。袁鐘宇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，茶籽多糖對肉雞盲腸中的大腸桿菌具有抑制作用，作用效果與抗生素相當(dāng)。本試驗結(jié)果與之相一致，結(jié)果顯示，飼糧中添加茶籽多糖降低肉雞空腸內(nèi)容物中的大腸桿菌數(shù)量，但差異不顯著，與抗生素的效果相當(dāng)。本試驗結(jié)果亦表明，飼糧中添加茶籽多糖和博落回生物堿對空腸內(nèi)容物中大腸桿菌和乳酸桿菌的作用效果與單獨添加茶籽多糖或博落回生物堿效果一致。這表明博落回生物堿和茶籽多糖可能通過促進(jìn)腸道有益菌的增殖，從而直接或間接抑制有害菌的生長，改善腸道菌群平衡，而二者聯(lián)合使用并沒有起到拮抗作用和疊加作用。

3.3 博落回血根堿的抑菌活性

博落回最早是作為植物源農(nóng)藥使用，其有效成分為天然物質(zhì)，使用后易降解，對環(huán)境污染小，且病蟲對其不易產(chǎn)生抗藥性。趙東亮等[15]研究發(fā)現(xiàn)，博落回生物堿對金黃色葡萄球菌、四連球菌和枯草芽孢桿菌具有較強的抑菌效果，對大腸桿菌無效果；血根堿對金黃色葡萄球菌、四連球菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果較強，對大腸桿菌效果較弱。郁建平等[16]研究發(fā)現(xiàn)，博落回總堿對毛霉的抑菌效果較好，而鹽酸血根堿對根霉、黃曲霉、黑曲霉、米曲霉、毛霉和木霉的抑菌效果較強，對青霉和酵母的抑菌效果較弱。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，博落回血根堿對大腸桿菌低度敏感，這與本試驗的體內(nèi)試驗結(jié)果相一致；博落回血根堿對金黃色葡萄球菌和巴氏桿菌中度敏感，對沙門氏菌高度敏感。王朝元等[17]試驗發(fā)現(xiàn)，博落回生物堿對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，與本試驗結(jié)果相似。而李美奎等[18]研究顯示，隨著博落回生物堿(生物總堿含量為64%，其中血根堿含量為45%，白屈菜紅堿含量為19%)濃度的增加，其對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果增強，抑制效果為金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門氏菌。這與本試驗的結(jié)果有不同之處，可能是由于博落回生物堿中有效成分含量的不同所產(chǎn)生的差異。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，博落回血根堿對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC均為25 μg/mL；對巴氏桿菌的MIC為12.5 μg/mL，對沙門氏菌的MIC為1.56 μg/mL，說明博落回血根堿對金黃色葡萄球菌和巴氏桿菌的抑菌效果較弱，對沙門氏菌的抑菌效果較強，抑菌活性強于青霉素鈉。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加茶籽多糖和博落回生物堿能夠改善黃羽肉雞的空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，其作用效果與抗生素相當(dāng)。

② 飼糧中添加茶籽多糖和博落回生物堿能顯著增加空腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量，二者聯(lián)合使用與單獨添加效果相當(dāng)，且效果均優(yōu)于抗生素，說明茶籽多糖和博落回生物堿均能替代抗生素。

③ 博落回血根堿對沙門氏菌的抑菌效果較強，優(yōu)于青霉素鈉，MIC為1.56 μg/mL。