張 婕 童津津 張 華 楊德蓮 孫銘維 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科技學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

反芻動物胃腸道內(nèi)的微生物發(fā)酵所產(chǎn)生的甲烷(CH4)是畜牧產(chǎn)業(yè)甲烷產(chǎn)生的主要途徑。據(jù)報道，每年全球反芻動物胃腸道CH4的排放量約占農(nóng)業(yè)領(lǐng)域總CH4排放量的58%[1]，而占世界總CH4排放量高達28%[2]。其中肉牛和奶牛所排放的CH4占74%[3]。隨著全球溫室效應(yīng)的逐漸加劇，如何減少反芻動物瘤胃CH4排放成為一個熱點問題。大量研究表明，化學(xué)飼料添加劑[4]、抗生素[5]、CH4抑制劑[6]和植物提取物[7]等均可改善反芻動物生產(chǎn)性能及減少CH4排放。然而，動物產(chǎn)品中化學(xué)殘留問題、抗生素的細菌耐藥性以及一些添加劑的過量毒性和成本問題限制了它們在動物營養(yǎng)中的利用[8]。因此，科學(xué)界仍在積極尋求可以提高瘤胃功能的飼料添加劑，在改善瘤胃發(fā)酵的同時有利于生態(tài)環(huán)境健康可持續(xù)發(fā)展。

殼聚糖是甲殼素脫乙?；玫降漠a(chǎn)物，是天然高分子質(zhì)量化合物。殼聚糖化學(xué)名稱是β-(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。20世紀(jì)70年代以來，人們對殼聚糖的研究有了很大的進步，已被作為“人體第六生命要素”進行深入研究和開發(fā)[9]。近年來，關(guān)于殼聚糖用于飼料添加劑改善瘤胃發(fā)酵的報道很多，李朝云等[10]的研究發(fā)現(xiàn)精粗比20∶80和50∶50時，添加殼聚糖能夠顯著增加山羊瘤胃液丙酸的摩爾比例，降低乙丙比；Henry等[11]的研究結(jié)果表明，在肉牛的飼糧中加入殼聚糖可以使肉牛的CH4排放量顯著下降。這些研究結(jié)果表明，在飼糧中添加殼聚糖對反芻動物瘤胃發(fā)酵及CH4產(chǎn)量會有一定影響，但有關(guān)其影響奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的報道不多且試驗結(jié)果不一致。因此，本研究旨在探究不同分子質(zhì)量及不同濃度的殼聚糖對奶牛體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，旨在為殼聚糖作為反芻動物飼料添加劑實際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所選用的殼聚糖分子質(zhì)量分別為1 000、3 000和50 000 u，均購自浙江金殼藥業(yè)有限公司，脫乙酰度85%以上，純度均在95%以上。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗選用3頭體況相近、健康狀況良好、裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛作為瘤胃液的供體。每日08：00和18：00飼喂全混合日糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 全混合日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content粗蛋白質(zhì) CP17.35中性洗滌纖維 NDF30.80酸性洗滌纖維 ADF16.50鈣 Ca0.74磷 P0.41

1)每千克預(yù)混料含有 One kg of premix contained the following: Cu 1 230 mg，Zn 4 950 mg，Mn 1 760 mg，I 50 mg，Se 61 mg，VA 230 000 IU，VD 350 000 IU，VE 1 000 IU。表2同。The same as Table 2.2)產(chǎn)奶凈能為計算值[12]，其他營養(yǎng)水平為實測值。表2同。NELwas a calculated value[12]，while the other nutrient levels were measured values. The same as Table 2.

1.3 發(fā)酵底物配制

發(fā)酵底物主要由蒸汽壓片玉米、豆粕、羊草、苜蓿組成，將飼料原料65 ℃烘干48 h，充分研磨過1 mm篩，按照底物配比，稱取各原料，混勻待用。發(fā)酵底物組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 發(fā)酵底物組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 試驗設(shè)計及方法

試驗采集早飼前奶牛瘤胃液進行體外發(fā)酵，從每頭牛的瘤胃采集0.5 L瘤胃液，均勻混合，用4層紗布過濾。

試驗選擇分子質(zhì)量分別為1 000、3 000和50 000 u的殼聚糖，每種分子質(zhì)量的殼聚糖再分別以底物0.4%、0.8%及1.6%的濃度添加到底物中，共設(shè)9個試驗組，另外設(shè)1組對照組(不添加殼聚糖)，每組4個重復(fù)，共重復(fù)3個批次。

按Menke等[13]方法進行體外發(fā)酵試驗，體外發(fā)酵液人工唾液鹽的配制見表3。取新鮮瘤胃液與人工唾液鹽混合液(瘤胃液∶人工唾液鹽=1∶2)70 mL加入發(fā)酵瓶中。向瓶中持續(xù)通入CO25 s后，立即加上瓶塞，并將每個發(fā)酵瓶與產(chǎn)氣裝置的每個傳感器相連接，后面連接氣袋以收集瘤胃體外發(fā)酵所產(chǎn)的氣體，于39 ℃下連續(xù)培養(yǎng)24 h，試驗重復(fù)3次。

表3 人工唾液鹽組成

使用SartoriusPB-20型pH計測定瘤胃培養(yǎng)液的pH。使用AGRS-Ⅲ微生物發(fā)酵微量產(chǎn)氣自動記錄儀測定24 h產(chǎn)氣量。氣袋收集發(fā)酵24 h后的氣體。使用安捷倫7890B型號氣相色譜儀用比色法測定瘤胃培養(yǎng)液的CH4產(chǎn)量。色譜儀條件為：熱導(dǎo)池(TCD)檢測器，載氣為氫氣，流量28 mL/min，PorapakQ填充柱，檢測器溫度100 ℃，進樣口溫度150 ℃，柱溫38 ℃，進樣量1 mL。

干物質(zhì)消化率的測定參考Tilley等[14]的方法。將發(fā)酵瓶內(nèi)殘渣用紗布過濾收集，用蒸餾水沖洗2次至50 mL離心管中，在4 ℃，5 400×g轉(zhuǎn)速下離心15 min，在烘箱中以105 ℃烘干24 h，計算飼料干物質(zhì)消化率。干物質(zhì)消化率計算公式為：

干物質(zhì)消化率(DM，%)=100×(樣本DM重-殘渣DM重+空白管DM重)/樣本DM重。

揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度以外標(biāo)法[15]測定。使用安捷倫7890B型號氣相色譜儀，色譜條件為：火焰氫離子檢測器溫度220 ℃，以氬氣作為載氣，流速30 mL/min，由氫氣發(fā)生器提供氫氣，流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，進樣量2 μL。

氨態(tài)氮(NH3-N)濃度利用靛酚比色法[16]測定。主要測定步驟如下：在試管中加入0.05 mL樣品，邊混合邊加入2.5 mL苯酚溶液，加入2.0 mL濃度為5.25%的次氯酸鈉溶液并搖勻，將試管置于95 ℃水浴5 min，60 ℃水浴10 min，取出冷卻后使用天美UV-2600紫外分光光度計于630 nm下比色。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件中全因子模型進行多因素方差分析和Duncan氏法多重比較檢驗。差異顯著定義為P<0.05。對組合效應(yīng)估算值進行t檢驗，其中方差分析中因子是殼聚糖分子質(zhì)量和殼聚糖濃度，水平分別為3種不同的分子質(zhì)量和3種不同濃度。統(tǒng)計分析模型為：

Yij=μ+αi+βj+εij。

式中：Yij表示觀測值;μ表示所有觀測值的平均值;αi表示不同分子質(zhì)量殼聚糖第i水平的處理效果(i=1，2，3)；βj表示不同濃度殼聚糖第j水平的處理效果(j=1，2，3)；εij表示隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對發(fā)酵液pH、NH3-N濃度及干物質(zhì)消化率的影響

由表4可知，除濃度為1.6%、分子質(zhì)量為1 000 u的殼聚糖組，其余殼聚糖組的發(fā)酵液pH均顯著低于對照組(P<0.05)。所有殼聚糖組NH3-N的濃度均顯著低于對照組(P<0.05)，而且濃度為0.4%的殼聚糖組隨著添加殼聚糖的分子質(zhì)量的提高，NH3-N濃度顯著降低(P<0.05)。所有殼聚糖組的干物質(zhì)消化率與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 殼聚糖對體外產(chǎn)氣量變化的影響

由表5可知，除濃度為0.8%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組外，其余殼聚糖組的總產(chǎn)氣量顯著高于對照組(P<0.05)，濃度為0.8%的殼聚糖組和濃度為1.6%的殼聚糖組，隨著添加殼聚糖分子質(zhì)量的提高，總產(chǎn)氣量顯著下降(P<0.05)。所有殼聚糖組產(chǎn)生氫氣體積與對照組均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，所有殼聚糖組產(chǎn)生CH4的體積均無顯著差異(P>0.05)，其中分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組產(chǎn)生CH4的體積有降低趨勢(0.05≤P<0.10)。

表4 殼聚糖對發(fā)酵液pH、NH3-N濃度及干物質(zhì)消化率的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.3 殼聚糖對發(fā)酵液VFA濃度的影響

由表6可知，濃度為0.4%、分子質(zhì)量為1 000 u的殼聚糖組總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度與對照組相比顯著下降(P<0.05)，其余各殼聚糖組與對照組差異均不顯著(P>0.05)。濃度為0.4%的殼聚糖組的TVFA濃度隨著添加殼聚糖分子質(zhì)量的提高而顯著升高(P<0.05)。所有殼聚糖組的乙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸濃度與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。而殼聚糖組的丙酸濃度均顯著高于對照組(P<0.05)，且隨著添加殼聚糖分子質(zhì)量的提高，濃度為0.4%、0.8%的殼聚糖組的丙酸濃度均顯著升高(P<0.05)。所有殼聚糖組的乙酸/丙酸與對照組相比均顯著降低(P<0.05)，各殼聚糖組之間差異不顯著(P>0.05)。

表5 殼聚糖對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量、CH4及H2體積的影響

表6 殼聚糖對發(fā)酵液VFA濃度的影響

續(xù)表6項目Items乙酸Acetic acid/%丙酸Propionic acid/%異丁酸Isobutyric acid/%丁酸Butyric acid/%異戊酸Isovaleric acid/%戊酸Valeric acid/%乙酸/丙酸Acetic acid/propionic acid總揮發(fā)性脂肪酸TVFA/(mmol/L)P值 P-value濃度 Concentration0.4160.0280.7890.5160.7940.8970.0220.031分子質(zhì)量 Molecular weight0.5720.0410.9410.6830.9900.3800.0940.076濃度×分子質(zhì)量 Concentration×molecular weight0.7920.2020.9910.9890.9990.9860.0370.303

3 討 論

3.1 殼聚糖對發(fā)酵液pH、NH3-N濃度及干物質(zhì)消化率影響

本試驗研究結(jié)果表明，殼聚糖可以顯著降低發(fā)酵液的pH，但均在正常值范圍之內(nèi)。pH是衡量反芻動物瘤胃發(fā)酵的一個重要指標(biāo)，保持pH在一個正常的范圍內(nèi)是保證瘤胃正常發(fā)酵的前提[17]。據(jù)報道，在體外發(fā)酵系統(tǒng)中，影響發(fā)酵液pH的主要因素是內(nèi)堿性物質(zhì)(如NH3-N)和有機酸的產(chǎn)生[18]。本試驗中pH降低可能是由于NH3-N的濃度顯著降低造成的。瘤胃液中的NH3-N濃度是瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)的一個重要指標(biāo)，反映了瘤胃內(nèi)微生物氮的供應(yīng)狀況。本研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖可以顯著降低瘤胃發(fā)酵液的NH3-N濃度。與任海軍[19]和田雨佳等[20]的研究結(jié)果有所不同。這可能是他們所選用的殼聚糖濃度及分子質(zhì)量與本試驗不同造成的。李朝云[21]的研究結(jié)果與本試驗結(jié)果相同，即添加殼聚糖能夠顯著降低瘤胃液NH3-N濃度。NH3-N濃度的降低可能說明了瘤胃菌群結(jié)構(gòu)有所變化。

3.2 殼聚糖對發(fā)酵液產(chǎn)氣量、CH4和H2體積的影響

本試驗中，除濃度為0.8%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組外，其余殼聚糖組的總產(chǎn)氣量顯著高于對照組，且不影響干物質(zhì)消化率。有報道稱，體外培養(yǎng)時產(chǎn)氣量越高，說明飼糧在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵活動越劇烈[22]。本研究發(fā)現(xiàn)添加殼聚糖有利于飼糧在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵。這與Goiri等[23]的研究結(jié)果不同。這可能是由于所選擇的殼聚糖不同造成的，本試驗所選擇的小分子質(zhì)量殼聚糖與3種濃度更有利于飼糧在瘤胃中的發(fā)酵。

本試驗中，濃度為1.6%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組及濃度為0.8%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組瘤胃發(fā)酵液的CH4產(chǎn)量有降低趨勢。根據(jù)瘤胃CH4及VFA生成機制[24]，在瘤胃內(nèi)生成丙酸，可以競爭性消耗氫氣，從而有效地抑制CH4形成。雖然本研究結(jié)果顯示生成氫氣的體積無顯著變化，但氫氣很可能處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)。本試驗研究結(jié)果表明，添加殼聚糖能使丙酸濃度顯著升高，因此濃度為1.6%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組及濃度為0.8%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組CH4體積有降低趨勢的原因很可能是因為生成丙酸，競爭性結(jié)合氫氣導(dǎo)致的。

3.3 殼聚糖對發(fā)酵液VFA濃度的影響

VFA的主要作用是為動物生產(chǎn)提供能量以及維持瘤胃環(huán)境[25]。根據(jù)本試驗結(jié)果，添加殼聚糖可顯著提高瘤胃發(fā)酵液的丙酸濃度，顯著降低乙酸/丙酸，雖然乙酸濃度沒有顯著變化，但仍可以認為殼聚糖可以改變瘤胃發(fā)酵模式，使瘤胃的發(fā)酵類型由乙酸型發(fā)酵向丙酸型發(fā)酵過渡，這是目前飼料添加劑抑制反芻動物瘤胃CH4生成的主要機理之一[26]。

本試驗結(jié)果顯示，殼聚糖可以使發(fā)酵液的丙酸濃度升高，進而促使乙酸/丙酸降低，改變瘤胃發(fā)酵模式，推測與殼聚糖的抗菌作用密不可分。有報道稱，殼聚糖的主要抗菌作用模式是由于殼聚糖聚陽離子，會吸引微生物表面上的負電荷，從而引起細胞滲透性變化。這些靜電相互作用，促進微生物細胞壁中肽聚糖的水解，并最終促使細胞裂解[27]。由于肽聚糖層在革蘭氏陽性細菌中比在革蘭陰性細菌中更多，因此，殼聚糖的抗菌作用對革蘭氏陽性細菌更為顯著[28]。殼聚糖對革蘭氏陽性細菌的抗菌作用更明顯，瘤胃中主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸的厚壁菌門就是革蘭氏陽性菌，而主要產(chǎn)物為丙酸的擬桿菌門和變形桿菌門都是革蘭氏陰性細菌[29]。從這個角度可以得出，由于殼聚糖對革蘭氏陽性細菌的抗菌作用，導(dǎo)致了產(chǎn)乙酸菌的菌群豐度下降，產(chǎn)丙酸菌的菌群豐度上升[30]，從而進一步導(dǎo)致了發(fā)酵液各VFA濃度的改變，最終使瘤胃發(fā)酵模式發(fā)生改變。但殼聚糖具體是如何作用于瘤胃菌群的，還需要進一步的試驗研究證明。本試驗的研究結(jié)果與Belanche等[30]以及任海軍等[31]的體外發(fā)酵研究結(jié)果基本一致。

本試驗結(jié)果顯示殼聚糖對體外發(fā)酵液的乙酸濃度無影響，然而在Belanche等[30]的研究結(jié)果中，殼聚糖還能夠使發(fā)酵液的乙酸濃度顯著降低，研究結(jié)果不同可能是由于所選殼聚糖分子質(zhì)量不同，本試驗使用的3種不同分子質(zhì)量的殼聚糖均屬于低分子質(zhì)量殼聚糖，分子質(zhì)量過小可能不足以使乙酸濃度降低。具體原因還需進一步驗證。

此外，本研究中，濃度為1.6%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組及濃度為0.8%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組的添加效果最好。這2個組不但與其他組別一樣顯著提高了發(fā)酵液的丙酸濃度，顯著降低了乙酸/丙酸，還能夠使發(fā)酵液所生產(chǎn)的CH4體積有降低趨勢，但是濃度為0.8%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組有使干物質(zhì)消化率下降的趨勢，因此，濃度為1.6%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖最為適宜。

4 結(jié) 論

① 與對照組相比，添加殼聚糖可以顯著降低瘤胃發(fā)酵液NH3-N濃度，顯著增加發(fā)酵液的丙酸濃度，顯著降低乙酸/丙酸，促進瘤胃發(fā)酵模式的改變。

② 與對照組相比，濃度為1.6%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組及濃度為0.8%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖組發(fā)酵液CH4體積有降低趨勢。

③ 添加濃度為1.6%、分子質(zhì)量為50 000 u的殼聚糖對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響和抑制甲烷產(chǎn)生效果最為顯著。