曹志軍，趙雪平，劉敏，趙亞利，李洵洲

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭，014109)

0 引 言

牛乳所含營(yíng)養(yǎng)成分齊全，其中乳蛋白是乳中主要的營(yíng)養(yǎng)成分，其組成較復(fù)雜。乳蛋白除了提供營(yíng)養(yǎng)和具有許多生理功能外，還是遺傳信息的攜帶者，因此研究乳蛋白的組成和含量對(duì)于評(píng)價(jià)乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和加工特性以及指導(dǎo)遺傳育種具有非常重要的意義。乳中的蛋白質(zhì)主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，酪蛋白主要由αs-CN、β-CN和κ-CN組成[1]，其含量及占總酪蛋白的比率影響乳的組成及乳的凝乳特性[2-3]；乳清蛋白主要由α-La和β-Lg等組成[4-5]，能夠發(fā)生相互作用并且凝集[6]。乳蛋白具有遺傳多態(tài)性，每種乳蛋白有一種或幾種遺傳性變異體[7]，奶牛胎次、哺乳動(dòng)物種類、品種及動(dòng)物的泌乳期和飼喂條件等因素影響乳中乳蛋白的含量。目前，乳蛋白分離和測(cè)定的方法有高效毛細(xì)管電泳[8]、雙向凝膠電泳[9]和反相高效液相色譜法[10]，具有高分辨率和高靈敏度的液相色譜法（RP-HPLC）在分離和測(cè)定荷斯坦因奶牛[11]、瘤牛[12]、西門塔爾牛[13]以及其它雜交奶牛基因多態(tài)性與其產(chǎn)奶性能的研究中也得到了廣泛應(yīng)用。本文采用SDS-PAGE和RP-HPLC相結(jié)合方法分析不同胎次、乳房炎乳及病牛牛乳中的乳蛋白，了解其組成成分及含量分布，為比較分析不同胎次與病牛牛乳中乳蛋白的差異奠定基礎(chǔ)，為牛乳的加工選擇原料乳提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1220型高效液相色譜儀，M illpore超純水系統(tǒng)，離心機(jī)，DYY—III型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀。

丙烯酰胺，Tris-HCL，N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，過硫酸銨(Ap)，四甲基乙二胺(TEM ED)，巰基乙醇，考馬斯亮蘭。

三氟乙酸(TFA)，乙腈，尿素，三羥甲基氨基甲烷(T ris堿)，檸檬酸鈉和二硫蘇糖醇（DTT）均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為M illpore超純水；αs-CN，β-CN，κ-CN，α-La和β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自sigm a公司。

1.2 方法

1.2.1 SDS-PAGE凝膠電泳的測(cè)定

SDS-PAGE電泳采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)的3%的濃縮膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%的分離膠進(jìn)行電泳測(cè)定[14]。

1.2.2 溶液制備

工作液A為165 mmoL/LT ris堿，8 mol/L尿素，5.37 mmol/L檸檬酸鈉，19.5 mm ol/LDDT的混合溶液；工作液B為4.5m o l/L尿素-0.1%三氟乙酸(TFA)。

1.2.3 樣品制備

（1）樣品采集。牛奶樣品均采自呼和浩特市犇騰牧業(yè)牛場(chǎng)。選取不同胎次健康荷斯坦奶牛50頭，病牛乳和乳房炎乳各50頭，每頭采集50 m L奶樣，各取500μL分裝于離心管中。

（2）樣品制備。各奶樣中加入等體積的工作液A，樣品混合后振蕩10 s混勻，室溫培養(yǎng)1 h。然后在4℃下以3 000 r/min離心10 min，除去表層乳脂，取一定體積下層清液，加入工作液B（1∶3體積比）稀釋，混勻，過濾到進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品制備

準(zhǔn)確稱取各蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，配制成10m g/m L溶液，后續(xù)操作如樣品制備。

1.2.5 反相高效液相色譜條件

色譜柱：C 18柱（150 mm×4.6 mm,3.5μm）；流動(dòng)相A為0.1%TFA水溶液，流動(dòng)相B為0.1%TFA乙腈溶液，經(jīng)抽濾、超聲脫氣后備用；流速1 m L/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；梯度洗脫程序：0～5 min，33～35%B；5～9 min，35～37%B；9～18 min，37～40%B；18～22 min，40～41%B；22～27.5 min，保持 41%B；27.5～28 min，41～43%B；28～36 min，43～45%B；36～45min，保持33%B[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將處理后的樣品溶液進(jìn)行液相色譜分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。根據(jù)樣品中出峰面積大小，計(jì)算出不同牛乳中主要蛋白質(zhì)的百分含量[16]，計(jì)算結(jié)果見表1。采用SPSS（17.0）軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 不同牛乳蛋白的百分含量 %

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類牛乳蛋白質(zhì)電泳分析

圖1 不同胎次牛乳與病牛乳電泳圖

采用SDS-PAGE的方法測(cè)定了不同胎次與病牛乳蛋白質(zhì)主要組成及蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量，結(jié)果如圖1所示。條帶M為蛋白質(zhì)標(biāo)樣，條帶1、2和3為不同胎次牛乳脫脂乳電泳圖，條帶4和5未知病牛乳和乳房炎牛乳。從電泳圖譜的負(fù)極(上)到正極(下)可以顯示9種蛋白(亞基)組分，將其分為上(大分子量)、中(中分子量)和下(小分子量)三組：由圖中可以看出，上端的大分子量組主要為乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白(IgG-H)，第3胎牛乳中免疫球蛋白含量高于第1和第2胎牛乳，這與M oore[17]研究一致。乳房炎乳5與病牛乳4在這一區(qū)域條帶較多，且條帶明顯下移，這一區(qū)域分子量范圍在50～70 ku之間；中間的中分子量組為三種酪蛋白(αs-CN、β-CN和κ-CN)，酪蛋白含量高，分子量在20～40 ku之間，主要集中在31 ku左右。除乳房炎乳下移之外，其余差別不大。并且3個(gè)胎次牛乳下面有IgG輕鏈。病牛乳沒有；下端的小分子量組主要包括β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，僅從分子量看，各胎次牛乳在此區(qū)間差別不大，α-La分子量大約為14 ku，β-Lg分子量大約為18 ku。乳房炎乳條帶較多，各蛋白質(zhì)分子量減小。分析圖譜各牛乳差別的原因，可能是由于乳房炎乳與不同胎次乳由于其蛋白在一級(jí)結(jié)構(gòu)上存在不同所致，因而造成蛋白質(zhì)在高級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量及所帶電荷的不同，最終體現(xiàn)在蛋白的遷移時(shí)間的不同。

2.2 不同種類乳蛋白質(zhì)RP-HPLC分析

2.2.1 標(biāo)品蛋白R(shí)P-HPLC分析

分別對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行蛋白色譜分析，結(jié)果見圖2圖3。在1.2.5色譜條件下，酪蛋白標(biāo)樣高效液相色譜圖出峰蛋白依次為κ-CN、αs-CN和β-CN，出峰時(shí)間大約為6 min、16 min和21 min。乳清蛋白標(biāo)樣高效液相色譜圖出峰蛋白依次為α-La和β-Lg，出峰時(shí)間為24 min和30 min。5種蛋白完全分離，分離效果較好。結(jié)果表明，在該色譜條件下進(jìn)行乳蛋白單體的分離是可行的。

圖2 牛乳乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

圖3 牛乳酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

2.2.2 不同牛乳中樣品中酪蛋白的變化規(guī)律分析

（1）κ-CN的分析。目前發(fā)現(xiàn)κ-CN有11種類型[18]，從圖4可以看出，3個(gè)胎次牛乳圖譜中，κ-CN在第1胎牛乳和第2、3胎牛乳圖譜中存在差異。圖5可以看出，病牛乳和乳房炎乳的κ-CN與圖4中存在明顯的差異，顯示其在不同種類牛乳中存在基因多態(tài)型。通過對(duì)其峰面積的計(jì)算比較其含量結(jié)果見表1，第1胎牛乳中κ-CN含量較高，達(dá)到12%，2和3胎牛乳中含量分別為11.6%和10%，呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，病牛乳和乳房炎乳的含量分別為6.27%和10.6%，由于其基因類型和含量之間存在差異，因此可能是導(dǎo)致在酸乳和干酪加工中采用酸凝和酶凝時(shí)凝固時(shí)間和凝塊硬度存在明顯差異的主要原因。

圖4 不同胎次牛乳蛋白質(zhì)組成的HPLC色譜圖

圖5 不同病牛牛乳蛋白質(zhì)組成的HPLC色譜圖

（2）αs-CN的分析。從圖4可以看出，3個(gè)胎次牛乳圖譜中，αs-CN在各胎次中基因類型相同，但在圖5中病牛乳與乳房炎乳與圖4中存在明顯差異，可見，當(dāng)乳牛生病后乳中αs-CN基因出現(xiàn)明顯變化。目前發(fā)現(xiàn)αs1-CN有9種多態(tài)性，αs2-CN有4種多態(tài)性，由于這次試驗(yàn)只有αs-CN混合標(biāo)準(zhǔn)品，無單獨(dú)的αs1-CN和αs2-CN標(biāo)準(zhǔn)品，因此無法對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)的計(jì)量，從表1可以看出，第1胎中αs-CN含量占28.5%,第2胎和第3胎中占到44.4%和54.6%，由此可出，隨著產(chǎn)胎次數(shù)增加，酪蛋白中αs-CN所占比例在增大，病牛乳和乳房炎乳的含量分別為30.24%和40.96%，處于中間狀態(tài)。

（3）各樣品中β-CN的分析。從圖4可以看出，β-CN在各胎次中基因多態(tài)性較明顯，圖5顯示兩種病牛乳中β-CN基因類型相近，各種類牛乳蛋白中以單體和雜合體形式出現(xiàn)。從表1可以看出，隨著產(chǎn)胎次數(shù)增加，所占百分?jǐn)?shù)在逐漸減少，由41.6%降低到32.5%，未知病牛乳中β-CN含量較高，達(dá)到40%，而乳房炎乳較低，含量?jī)H有32.2%。

2.2.3 不同牛乳樣品中乳清蛋白的變化規(guī)律

乳清蛋白中，β-Lg的多態(tài)性是最早被發(fā)現(xiàn)的，目前已發(fā)現(xiàn)11種類型[19]，從圖4可以看出，3個(gè)胎次牛乳中β-Lg呈現(xiàn)不同的基因形態(tài)，圖5中兩種病牛乳呈現(xiàn)的形態(tài)相同，但與正常牛乳形態(tài)不同。表1可以看出，β-Lg在第1胎次及兩種病牛乳中含量較多，分別為14.7%、23.5%和12.9%。在第2和3胎次中含量較低，達(dá)到4.74%和1.6%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，α-La只有1種，未見其多態(tài)性，目前發(fā)現(xiàn)α-La多態(tài)性最低，只有3種，且在病牛乳中未發(fā)現(xiàn)，與電泳結(jié)果有差異。并且α-La在乳蛋白中所占比例最小，最大只有3.28%左右。

3 結(jié)論

乳房炎乳與末知病牛乳與不同胎次牛乳電泳圖譜在乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白(IgG-H)這一區(qū)域條帶較多，且條帶明顯下移；中間的中分子量組為三種酪蛋白(αs-CN、β-CN和K-CN)，其含量較高，分子量在20～40 ku之間，主要集中在31 ku左右。除乳房炎乳下移之外，其余差別不大；α-La和β-Lg僅從分子量看，各胎次牛乳在此區(qū)間差別不大，其中α-La分子量大約為14 ku，β-Lg分子量大約為18 ku。乳房炎乳條帶較多，與其它牛乳相比差別較明顯。

通過對(duì)不同種類牛乳蛋白色譜分析可知，κ-CN在不同牛乳中存在明顯的差異，隨著胎次增加含量減少，病牛乳和乳房炎乳的含量較低；αs-CN在各胎次中乳蛋白多態(tài)性類型相同，但在病牛乳與乳房炎乳差異明顯，隨著產(chǎn)胎次數(shù)增加，αs-CN所占比例在增大，病牛乳和乳房炎乳的含量分別為30.24%和40.96%，處于中間狀態(tài)；β-CN在各胎次中乳蛋白多態(tài)性較明顯，隨著產(chǎn)胎次數(shù)增加，所占百分?jǐn)?shù)在逐漸減少，兩種病牛乳中β-CN基因類型相近，含量居中；α-La未見其多態(tài)性，且在乳蛋白中所占比例最小，并且在未知病牛中未檢測(cè)到；3個(gè)胎次牛乳中β-Lg呈現(xiàn)不同的基因形態(tài)，兩種病牛乳呈現(xiàn)的形態(tài)相同，但與正常牛乳形態(tài)不同。在第1胎次及兩種不同病牛乳中含量較多，在第2和3胎次中含量較低。