張李偉，劉暢，張英華

（1.囯家食品藥品監(jiān)督管理總局保健食品審評(píng)中心，北京100070；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

0 引 言

乳酸菌在食品工業(yè)中扮演著重要角色，在工業(yè)化應(yīng)用過程中，乳酸菌多處于低溫狀態(tài)。由于溫度的突然降低，微生物自身要經(jīng)受一系列物理和化學(xué)變化，包括一系列蛋白的合成[1]，稱為冷應(yīng)激蛋白。冷應(yīng)激蛋白的存在使菌體的耐冷能力增強(qiáng)[2]，這種過程可看成是微生物在低溫條件下保護(hù)自己的一種機(jī)制[3]。

Kim[4]將乳桿菌經(jīng)冷應(yīng)激處理后，菌體內(nèi)出現(xiàn)一種分子量約6.3 ku的蛋白，而未經(jīng)處理的乳桿菌不含這種蛋白。本課題組為了研究乳酸乳球菌中冷休克蛋白CspC、CspD的作用，將冷休克蛋白CspC、CspD基因分別重組到質(zhì)粒pN Z 8148，轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ 9000后，加入N isin誘導(dǎo)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。比較了重組菌與空白菌在30℃條件下菌體生長(zhǎng)差異及反復(fù)凍融活菌數(shù)的差異[5]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用三株乳酸菌(表達(dá)菌），NZ 9000/PNZ8148/CspC，NZ9000/PNZ 8148/CspD，對(duì) 照 菌 NZ9000/PN Z 8148來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；乳品工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDSD ICC）。培養(yǎng)基為M 17。

試劑：亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

將活化好的菌株40℃培養(yǎng)至OD=0.35時(shí)，加入質(zhì)量濃度為0.5 ng/m L的N isin誘導(dǎo)產(chǎn)生冷休克蛋白。培養(yǎng)OD值達(dá)到1時(shí)，4 000 g離心，重懸于新鮮的M 17培養(yǎng)基中。

1.2.2 發(fā)酵酸奶彈性模量和黏性模量的測(cè)定

（1）凝膠形成過程中，儲(chǔ)能模量和損耗模量的測(cè)試。將菌株以2%接菌量接種于12%脫脂乳，發(fā)酵溫度42℃，發(fā)酵終點(diǎn)控制在pH值為4.6。

樣品經(jīng)充分?jǐn)嚢柚篑R上放到流變儀的托盤上，用平面刮刀將多余的樣品刮掉，撥開插銷進(jìn)行測(cè)試，并用硅油將盤口液封。選用夾具為錐角4℃、直徑40 mm的模具，測(cè)試間距為1 000μm，頻率為1 H z。測(cè)試G'和G"，同時(shí)檢測(cè)樣品的酸度，當(dāng)樣品達(dá)到pH值達(dá)到4.6，此時(shí)停止測(cè)試。

（2）凝膠形成之后，彈性模量和黏性模量的測(cè)試。流變托盤上的樣品pH值已達(dá)到4.6之后，凝膠已形成，測(cè)定其模量隨頻率變化規(guī)律，頻率0.1～10H z，選取100個(gè)點(diǎn)，剪切應(yīng)變0.5%，記錄G'和G"。

1.2.3 胞外多糖的產(chǎn)量

將實(shí)驗(yàn)菌株于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%脫脂乳中活化3代；活化好的菌株以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量發(fā)酵12%脫脂乳，控制發(fā)酵終點(diǎn)為pH 4.6，稱取15 g發(fā)酵乳于100 m L容量瓶中并以15 g的脫脂乳（未發(fā)酵）作為空白對(duì)照進(jìn)行多糖的提取處理，最后利用苯酚硫酸法對(duì)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行檢測(cè)。

準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖100 m g，蒸餾水準(zhǔn)確定容至100m L質(zhì)量濃度為1m g/L的葡萄糖液，搖勻后準(zhǔn)確吸取10m L該溶液，用蒸餾水稀釋定容至100m L，即得質(zhì)量濃度100μg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

取8支干凈的具塞試管按表1方法操作，搖勻后放置5min，置沸水浴中加熱15 min，取出迅速冷卻至室溫，以0號(hào)作為空白調(diào)零，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)（μg/m L），吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法 m L

胞外多糖的提取及測(cè)定方法：稱取15 g待測(cè)樣品于100 m L容量瓶中，分別加入亞鐵氰化鉀（10.6%）和乙酸鋅溶液（21.9%）各5 m L并定容；靜置30 min以沉淀蛋白；過濾除去蛋白，取4m L上清液用15m L無水乙醇沉淀胞外多糖；隨后以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，棄去上清液獲得沉淀的多糖；用體積分?jǐn)?shù)為85%乙醇洗滌沉淀2次（每次洗滌后以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min）；用10 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%硫酸溶解多糖沉淀；取多糖溶液2 m L于具塞試管中，加入1m L 6%苯酚和5 m L濃硫酸并混勻；試管于沸水浴中加熱15 min；取出迅速將溫度冷卻至室溫于490 nm下測(cè)定吸光值，并利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行質(zhì)量濃度計(jì)算，最終多糖的質(zhì)量濃度需減去未發(fā)酵脫脂乳的測(cè)定值。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷休克蛋白的超量表達(dá)對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響

將超量表達(dá)冷休克蛋白C和D的菌株，以脫脂乳為培養(yǎng)基，42℃條件下培養(yǎng)24 h，定期取樣進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，超量表達(dá)菌株在42℃條件下，4 h內(nèi)的發(fā)酵前期，活菌數(shù)略低于對(duì)照菌株，進(jìn)入平臺(tái)期之后，3個(gè)樣品的活菌數(shù)趨于一致，但是培養(yǎng)18 h之后，對(duì)照菌株活菌數(shù)略有下降，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果低于兩株超量表達(dá)冷休克蛋白的菌株。這一結(jié)果和之前課題組30℃條件下培養(yǎng)的情況不一致，分析原因，可能是冷休克蛋白只在低溫條件下起作用。因而在正常培養(yǎng)的溫度條件下的初期，對(duì)照菌株具有一定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

圖1 菌株的生長(zhǎng)曲線

2.2 冷休克蛋白超量表達(dá)對(duì)酸奶酸度的影響

將超量表達(dá)冷休克蛋白C和D的菌株，以脫脂乳為培養(yǎng)基，42℃條件下培養(yǎng)24 h，定期取樣進(jìn)行發(fā)酵體系pH值的測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，超量表達(dá)菌株在42℃條件下，4 h內(nèi)的發(fā)酵前期，和對(duì)照菌株相比較其酸度的改變幾本一致，在平臺(tái)期之后，對(duì)照菌株的發(fā)酵體系酸度略低于表達(dá)菌株，但是在培養(yǎng)超過18 h之后，對(duì)照菌株體系的酸度值明顯低于表達(dá)菌株。這一結(jié)果和生長(zhǎng)曲線的情況一致，說明在超長(zhǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的條件下，表達(dá)菌株具有一定的自我修復(fù)能力，通過抑制產(chǎn)酸，控制環(huán)境pH值的改變量，從而更好的適應(yīng)環(huán)境的變化，保持較高的活菌數(shù)和菌體活力。

圖2 冷休克蛋白的超量表達(dá)對(duì)酸奶酸度的影響

2.3 冷休克蛋白的超量表達(dá)對(duì)酸奶質(zhì)構(gòu)的影響

在乳酸菌的酸化過程中，定時(shí)測(cè)定彈性模量和粘性模量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，彈性模量和粘性模量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，兩者的變化趨勢(shì)相似。高效表達(dá)冷休克蛋白C和D的樣品體系，在發(fā)酵初期彈性模量和黏性模量均明顯高于對(duì)照組，經(jīng)過兩個(gè)小時(shí)以后，變化趨于平穩(wěn)。這一結(jié)果說明表達(dá)菌株發(fā)酵體系的質(zhì)構(gòu)更為緊密，隨著酸度的下降，大分子，包括蛋白質(zhì)和脂肪分子形成更加致密的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并且鎖定水分子的能力增加，這樣會(huì)改善發(fā)酵酸奶的持水能力，從而減少乳清析出量。同時(shí)，由表達(dá)菌株發(fā)酵體系的黏性模量高于對(duì)照組，可能是在發(fā)酵過程中生成了較多的高分子物質(zhì)，能夠增加體系的黏度，在隨后的實(shí)驗(yàn)中，又進(jìn)一步分析了胞外多糖的產(chǎn)量，其結(jié)果和質(zhì)構(gòu)分析的一致。

圖3 冷休克蛋白的超量表達(dá)對(duì)酸奶質(zhì)構(gòu)的影響

2.4 冷休克蛋白的超量表達(dá)對(duì)酸奶發(fā)酵后質(zhì)構(gòu)的影響

以表達(dá)菌株和對(duì)照樣發(fā)酵脫脂乳，達(dá)到pH值為4.6以后，停止發(fā)酵，測(cè)定酸化之后樣品發(fā)酵體系的彈性模量和黏性模量，目的是分析比較發(fā)酵體系的質(zhì)構(gòu)保持能力。所得結(jié)果如圖4所示。

圖4 酸奶酸化后質(zhì)構(gòu)分析

由圖4中的數(shù)據(jù)線的差別可知，隨著測(cè)定頻率的增加，樣品彈性模量和黏性模量都增加。頻率的增加到一定值之后，彈性模量和黏性模量最后趨于平緩。幾乎在全部的頻率范圍，表達(dá)菌株的彈性模量和黏性模量明顯高于對(duì)照樣品。說明表達(dá)菌株發(fā)酵體系形成的微觀結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定結(jié)實(shí)。這和之前發(fā)酵過程中的質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果一致。表達(dá)菌株發(fā)酵體系形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的交聯(lián)度高，網(wǎng)絡(luò)的分枝多，空隙細(xì)小而且大小分布均勻，所制備凝膠酸乳凝膠的硬度、黏度較大，持水能力增強(qiáng)，并且其微觀結(jié)構(gòu)更致密，均勻，體系中可能大分子蛋白質(zhì)為主，長(zhǎng)鏈分子較多，在凝膠過程中可以形成較多的活性結(jié)晶域，與凝膠酸乳中的分子成分形成大分子纏繞結(jié)構(gòu)。形成彼此連接的結(jié)點(diǎn)較多，連接較為緊密，所形成凝膠的凝膠強(qiáng)度也較大。這種結(jié)構(gòu)明顯的影響了酸乳凝膠的力學(xué)性質(zhì)，提高了酸凝膠的物理特性，黏度、硬度增加。凝膠酸乳形成了更細(xì)小的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)水分的包容、束縛能力增強(qiáng)，使凝膠網(wǎng)絡(luò)中的水分不易析出，可以減少乳清析出傾向。

2.5 冷誘導(dǎo)對(duì)酸奶胞外多糖產(chǎn)量的影響

鑒于前面質(zhì)構(gòu)分析的結(jié)果，發(fā)酵過程中和發(fā)酵后表達(dá)菌株體系的彈性模量和黏性模量都明顯高于對(duì)照組，分析其原因可能有兩個(gè)方面：發(fā)酵過程中，表達(dá)菌株的發(fā)酵體系的酸度下降較為緩慢，這種情況更容易形成致密的酸凝膠，同時(shí)酸度下降慢會(huì)導(dǎo)致大分子水解程度低，大分子更容易形成結(jié)點(diǎn)較多的纏繞結(jié)構(gòu)。另外，較高的黏性模量值可能來自于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胞外多糖。分析了發(fā)酵24 h胞外多糖的產(chǎn)量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酸奶發(fā)酵過程中胞外多糖產(chǎn)量分析

由圖5可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外多糖產(chǎn)量持續(xù)增加，并且最后在15 h以后逐漸趨于平緩。同時(shí)表達(dá)菌株的胞外多糖產(chǎn)量一直明顯高于對(duì)照組，這一結(jié)果很好的說明了質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果中黏性模量的差異性。

有研究報(bào)告表明，乳酸菌胞外多糖有利于保護(hù)菌體在極端不良環(huán)境條件下的適應(yīng)性，其中就包括對(duì)溫度變化的適應(yīng)性[6]，由本研究得到的結(jié)果可以推斷出，高效表達(dá)的冷休克蛋白是菌株適應(yīng)低溫環(huán)境條件的保護(hù)機(jī)制，CSPs都是由68到74個(gè)氨基酸構(gòu)成的小分子蛋白質(zhì)，而且它們之間具有較高的同源性(44%～80%)。目前對(duì)冷休克蛋白在細(xì)胞生理學(xué)中的功能研究有限，CSPs參與了翻譯、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞核形成過程[7]。就像熱休克蛋白一樣，CSPs不僅在低溫下有作用，在常溫下也有重要作用，其主要功能與生物體的抗凍性有關(guān)。普遍認(rèn)為CSPs的功能是作為RNA分子伴侶與細(xì)胞中的m RNA結(jié)合[8]。一種假設(shè)認(rèn)為CspAEC通過對(duì)核糖核酸酶作用刺激RNA水解，大概是通過阻止m RNA形成對(duì)抗核糖核酸酶的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)[9]。而冷休克蛋白調(diào)控產(chǎn)生大量的胞外多糖可能是保護(hù)菌體適應(yīng)低溫環(huán)境條件的保護(hù)措施。進(jìn)一步的機(jī)理還有待探索。

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，超量表達(dá)冷休克蛋白CspD和CspD的菌株在正常發(fā)酵條件下，菌株活力和生長(zhǎng)狀態(tài)沒有明顯改變。表達(dá)菌株具有一定的自我修復(fù)能力，通過抑制產(chǎn)酸，控制環(huán)境pH的改變量，從而更好的適應(yīng)環(huán)境的變化，保持較高的活菌數(shù)和菌體活力。高效表達(dá)冷休克蛋白C和D的樣品體系，在發(fā)酵初期和發(fā)酵后彈性模量和黏性模量均明顯高于對(duì)照組，胞外多糖產(chǎn)量一直明顯高于對(duì)照組?？赡苁潜Ｗo(hù)菌體適應(yīng)低溫環(huán)境條件的保護(hù)措施。