王江濤 黎 殷* 彭 輝 文兆明 肖仁斌 吳 娟

（1 湘雅萍礦合作醫(yī)院（萍礦總醫(yī)院），江西 萍鄉(xiāng) 337000；2 萍鄉(xiāng)衛(wèi)生職業(yè)學院，江西 萍鄉(xiāng) 337000）

鼻咽癌是中國南方常見的一種惡性腫瘤[1]，大部分患者因頸部腫物等臨床體征而就診穿刺或活檢被確診鼻咽癌時，患者已經(jīng)處于中晚期，此時已發(fā)現(xiàn)了頸部淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，甚至大部分患者已發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[2]。研究[3]報道鼻咽癌常見的轉(zhuǎn)移部位是骨、肺、肝、縱隔及腹腔內(nèi)淋巴結(jié)，根治性放化療后，鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移中骨轉(zhuǎn)移高達75%。提高鼻咽癌的療效和治愈率及避免其骨轉(zhuǎn)移，深入探究其分子機制探究，己經(jīng)成為鼻咽癌研究中最關(guān)鍵的問題之一，對于有效控制骨痛和減少骨折相關(guān)事件也極為重要。RANK-RANKLOPG基因構(gòu)成的RANK/RANKL/OPG軸直接參與了機體破骨細胞的活性及功能調(diào)節(jié)，在破骨細胞表達和調(diào)控中占主導地位，對骨組織的生理、病理學改變也具有極大作用[4]。既往研究[5]表明，RANK/RANKL/OPG軸不僅與原發(fā)性的骨腫瘤有關(guān)聯(lián)，而且還涉及許多惡性腫瘤如乳腺癌、前列腺癌等的骨轉(zhuǎn)移，特別是介導了腫瘤骨轉(zhuǎn)移部位溶骨（或成骨）性破壞，導致腫瘤性骨破壞的發(fā)生。近年來，對RANK/RANKL/OPG軸在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機制的研究，僅僅在局限在乳腺癌、前列腺癌及肺癌等的報道[5-6]，RANK/RANKL/OPG軸在鼻咽癌的研究進展機制仍是空白。本研究旨在觀察RANK/RANKL/OPG基因通路表達高低與臨床鼻咽癌骨轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，探索RANK/RANKL/OPG基因通路在人鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展過程和骨轉(zhuǎn)移中的臨床意義和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料：選取2016年7月至2018年7月江西省萍鄉(xiāng)市湘雅萍礦合作醫(yī)院的耳鼻喉科，50例經(jīng)病理診斷確診為鼻咽癌的患者，取其癌組織、癌旁組織（距離腫瘤3～5 cm的組織）；所有入選患者術(shù)前均未接受過放療、化療或生物治療等干預(yù)措施；50例鼻咽癌患者中（男27例，女23例），年齡42～72歲，平均年齡（61.15±6.21）歲；TNM分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第7版標準進行，其中Ⅰ期11例，Ⅱ期10例，Ⅲ期13例，Ⅳ期16例。所有患者行鼻咽和頸部MRI檢查（GE公司，1.5T）。

1.2 標本制備：每例新鮮標本的一部分固定在中性福爾馬林液中，并通過脫水、透明、浸蠟與石蠟包埋保存，備用于免疫組化實驗。另一部分置于凍存管中放入液氮冷凍，以備用于RT-PCR實驗。

1.3 實驗試劑及材料：即用型免疫組化Envision染色試劑盒、重組OPG和人類RANKL單克隆抗體AMG-162，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；氯仿分析純（浙江迪耳藥業(yè)有限公司）、DEPC（SIGMA AND AMERSCO）、異丙醇分析純（浙江杭州雙林化工試劑廠）；瓊脂糖（Agarose）（OXLOD）、溴化乙錠（EB）（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）、Goldview、溴酚蘭（上海賽百勝公司）、Trizol（Invitrogen）、 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）、Taq酶（Promega）、Oligod（T） Primers（Promega）、RNase Inhibitor（Promega）、dNTP（M.W）、Trisbase（Amersco）、arc（Amersco）、bis-arc（Amersco）、100 bp marker（Takara）、二甲基苯氰（Amersco）、MTT（Amersco）、L-谷氨酰胺（Amersco）、L-脯氨酸（Amersco）、以下引物均根據(jù)primer premier 5.0軟件設(shè)計，引物由上海生工有限公司合成 （β-actin上游：5’ACTGCCGCATCCTCTTCCTC 3’，β-actin 下游：5’ACTCCTGCTTGCTGATCCACAT 3’，598bp）。

1.4 實驗方法與步驟

1.4.1 免疫組織化學分析：將所有組織標本續(xù)切成5 μm厚，進行免疫組織化學染色（按產(chǎn)品說明書進行染色步驟）。5 μm石蠟切片脫蠟和水化后，以3% H2O2處理5 min；將檸檬酸鹽緩沖液在高壓下煮沸15 min，在室溫下冷卻20 min以進行抗原修復(fù)；50 μL過氧化酶阻斷溶液孵育15 min；50 μL正常非免疫動物血清孵育20 min；除去血清，加50 μL一抗體，4 ℃過夜；50 μL生物素標記的二抗體孵育20 min；與50 μL鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶溶液一起孵育20 min；加100 μL新鮮配制的DAB溶液顯色10 min；蘇木精復(fù)染后脫水、透明封片，光鏡下觀察結(jié)果（以PBS溶液替代一抗做陰性對照；以已知陽性切片做陽性對照）。

1.4.2 總RNA 的提?。孩偃〗M織30 mg，加入600 μL的裂解液中，研磨勻漿（勻漿器置于冰上），室溫下離心5 min，速度14000 xg；5提取上清液，加入等體積的70ā酒精混勻，將混勻的液體吸取750 μL轉(zhuǎn)入Hi Bind RNA小柱子上，套上2 mL收集管（試劑盒提供），室溫下離心1 min，離心速度10000 xg；③移棄離心液，將Hi Bind RNA小柱子套入新的2 mL收集管，室溫下再離心1 min（加入300 μL RNA洗脫液），離心速度10000 xg；④再次棄去離心液，將Hi Bind RNA小柱子套回2 mL收集管，加入500 μL RNA洗脫液Ⅰ，室溫下再離心1 min（離心速度10000 xg）；⑤又移棄離心液，將Hi Bind RNA小柱子套入新的2 mL收集管，加入500 μL RNA洗脫液Ⅱ，室溫下又離心1 min（離心速度10000 xg）；⑥第4次棄去離心液，將Hi Bind RNA小柱子套回2 mL收集管，加入500 μL RNA洗脫液Ⅱ，室溫下再離心1 min（離心速度10000 xg）；⑦第5次移棄離心液，將Hi Bind RNA小柱子套回2 mL收集管，空柱子室溫下再離心2 min（離心速度10000 xg）；⑧將Hi Bind RNA小柱子套入1.5 mL離心管（DEPC水處理過），加入40 μL DEPC 水于Hi Bind RNA小柱子中心，靜置1～2 min，室溫下再離心1 min（離心速度10000 xg）；⑨收集離心液，紫外分光光度計測定總RNA 純度，計算其濃度。

1.4.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄：①使用前輕輕混勻試劑盒中每個組分，然后以2000 rpm 離心20 s；②取滅菌且無核酸酶的0.2 mL 離心管，依次加入2～5 μg RNA、6 μL Oligo T（18） （10 μm）、 1 μL d NTPs（10 mmol/L） 及1 μL DEPC水至15.5 μL；③65 ℃保溫5 min，然后冰浴5 min；④往3步驟中的0.2 mL 離心管依次加入下列組分：RNase抑制劑（40 U/μL）0.5 μL、10×M-MLV Reaction Buffer 2 μL DTT（mmol/L）1 μL及逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）1 μL；⑤輕輕混勻后，2000 rpm再離心20 s；⑥先在37 ℃保溫1 h，然后70 ℃保溫15 min；⑦上述產(chǎn)物立即進行下一步的real-time PCR反應(yīng)或-20 ℃保存。

1.4.4 Real-time PCR定量檢測與計算：①取滅菌且無核酸酶的0.2 mL離心管，依次加入2×Master Mix SYBR Green I （TaKaRa，日本） 10 μL，上游引物0.25 μmol/L，下游引物0.25 μmol/L；CDNA（RT反應(yīng)產(chǎn)物）模板2 μL和滅菌雙蒸水加dd H2O至20 μL。②輕輕震蕩30 s后進行PCR 擴增，PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，退火15 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)72 ℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。③根據(jù)每個循環(huán)的熔解曲線來鑒定特異性 cDNA 產(chǎn)物。④用Roche Light Cycler 480 軟件分析結(jié)果。相應(yīng)的mRNA含量用2-Ct方法計算相對含量（RQ），每個樣本重復(fù)測定3次。

1.5 統(tǒng)計分析：采用統(tǒng)計學軟件spss23.0對取得的數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計、計量資料用t檢驗，計數(shù)資料用卡方檢驗，相關(guān)性采用spearman相關(guān)分析。檢驗水準α=0.05。P＜0.05具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 鼻咽癌組織與癌旁組織RANK/RANKL/OPG的表達：50例患者癌組織RANK、RANKL、OPG陽性率分別為70.0%（35/50）、62.0%（31/50）與76.0%（38/50），癌旁組織RANK、RANKL、OPG陽性率分別為8.0%（4/50）、12%（6/50）與6%（3/50），差異具有統(tǒng)計學意義，χ2值分別為3.47、2.45與1.25，P值均小于0.05。癌組織與癌旁組織RANK/RANKL/OPG表達的定量分析比較亦均＜0.05。見表1、2。

2.2 RANK/RANKL/OPG的表達與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系：50例鼻咽癌組織RANK、RANKL、OPG陽性表達與患者性別、腫瘤大小及分化程度無關(guān)，P＞0.05；與年齡、浸潤深度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)，P＜0.05。其中浸潤鼻咽癌漿膜下RANK、RANKL、OPG陽性表達均顯著高于浸潤鼻咽癌肌層和黏膜層＋黏膜下層，隨著TNM分期升高，RANK、RANKL、OPG陽性表達均依次升高，陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠處轉(zhuǎn)移的癌組織RANK、RANKL、OPG陽性表達均高于癌旁組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠處轉(zhuǎn)移，差異均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05（表3）。癌組織頸部淋巴結(jié)受累數(shù)、淋巴結(jié)壞死、淋巴結(jié)最大徑和鎖骨上窩受累高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05（表3）。

2.3 RANK/RANKL/OPG的表達的相關(guān)性：50例鼻咽癌中，34例癌組織RANK/RANKL/OPG表達均陽性，16例均陰性者，癌組織與RANK/RANKL/OPG表達呈正相關(guān)，r=0.705，P=0.000。

表1 鼻咽癌與癌旁組織RANK/RANKL/OPG表達率的分析

表2 鼻咽癌與癌旁組織RANK/RANKL/OPG表達的定量分析（±s）

表2 鼻咽癌與癌旁組織RANK/RANKL/OPG表達的定量分析（±s）

指標 鼻咽癌組織組 癌旁組織組 t P RANK 1.547±0.883 0.949±0.181 4.691 0.008 RANKL 1.364±0.594 0.766±0.129 6.956 0.003 OPG 1.126±0.442 0.813±0.171 4.670 0.009

3 討 論

核因子κB 受體活化因子（receptor activator of NFκB，RANK）/核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NFκB ligand，RANKL）/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）信號通路是成骨細胞與破骨細胞之間通訊的重要信號通路。核因子κB 受體活化因子/核因子κB受體活化因子配體/骨保護素（RANK/RANKL/OPG）信號通路是近些年來骨代謝領(lǐng)域的一項重大發(fā)現(xiàn)。前期，激素、細胞因子與生長因子通過作用于RANK、RANKL、OPG影響骨代謝，而導致骨代謝疾病如骨質(zhì)疏松，溶骨性骨腫瘤及惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移等[7-8]。在臨床上Ⅰ期、Ⅱ期鼻咽癌多數(shù)為原位癌，無轉(zhuǎn)移，屬于早期癌，臨床癥狀也較輕，而Ⅲ期、Ⅳ期則屬于中晚期鼻咽癌，一般都存在器官或骨轉(zhuǎn)移，所以準確的臨床分期及合理治療的選擇，顯得尤為重要[9]。本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌癌組織中的RANK/RANKL /OPG信號通路的定性、定量表達都較癌旁組織高；且癌組織RANK、RANKL、OPG陽性表達與患者年齡、浸潤深度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)；且隨著鼻咽癌患者TNM分期的升高，RANK、RANKL、OPG陽性表達呈正向增高，陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠處轉(zhuǎn)移鼻咽癌RANK/RANKL /OPG信號高表達[10-11]。這均說明在鼻咽癌的早中晚要注意其骨代謝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，同時提示積極研發(fā)藥物及其他治療措施阻斷RANK/RANKL /OPG信號通路的表達有可能是解決鼻咽癌骨轉(zhuǎn)移的重要突破口。

表3 RANK/RANKL/OPG的表達與鼻咽癌臨床病理特征的相關(guān)性分析