厲曉臘，陳官菊，方鳴，金軼偉，劉又高，王根鍔，柴一秋

(浙江省亞熱帶作物研究所 溫州市蟲生真菌資源研究與開發(fā)重點實驗室，浙江 溫州 325005)

蟬花蟲草(Ophiocordycepssobolifera)含核苷類、蛋白類、糖類、生物堿類、甾醇類等生理活性物質(zhì)[1-5]，多糖是其中重要的一類。研究發(fā)現(xiàn)蟬花蟲草多糖具有抗腫瘤、抑制免疫、增強免疫、抗氧化、抗衰老、護肝、降血壓等藥理作用[6-15]，對病毒、細菌、真菌等微生物具有抑制作用[15-17]。多糖往往是由多個相同的單糖基以糖苷鍵相連而成的高聚物，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成難，多從天然產(chǎn)物中提取制備。多糖制備過程中雜有許多干擾因子，如游離蛋白、酚類、蒽醌衍生物等色素物質(zhì)，去除游離蛋白等干擾因子是多糖純化的關(guān)鍵步驟。粗多糖脫蛋白的常用方法有Sevag法、蛋白酶法、三氯乙酸法、氯化鈣法等，其中，Sevag法最為常用，其脫蛋白效果好且對多糖作用溫和，但其采用的氯仿等試劑具毒性，對人和環(huán)境不友好[18-19]。發(fā)展于20世紀(jì)60—70年代的大孔吸附樹脂，具有良好的分離兼脫蛋白、脫色等效果，且選擇性廣、吸附性佳、可再生，近十來年在多糖分離純化中被廣泛應(yīng)用[20-24]。本試驗采用大孔樹脂吸附法和Sevag法相結(jié)合，開展蟬花蟲草多糖去除蛋白研究，以期制備大量純度較高的蟬花蟲草多糖，為揭示蟬花蟲草多糖的藥理作用及推進蟬花蟲草多糖研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為人工栽培蟬花蟲草子實體的優(yōu)良菌株022007-9，該菌株由浙江省亞熱帶作物研究所植物保護與蟲生真菌研究室分離獲得，保存于中國微生物菌種保藏管委會普通微生物中心(CGMCC No:8989)。大孔吸附樹脂AB-8，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；牛血清白蛋白，sigma公司；苯酚、乙醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、硫酸、鹽酸和氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 蟬花蟲草粗多糖制備

蟬花蟲草子實體采摘后，培養(yǎng)基殘渣經(jīng)70 ℃烘箱烘干，放入提取罐，按照培養(yǎng)基殘渣質(zhì)量與提取液體積比1∶10的比例加50%乙醇浸提液，加熱至微沸狀態(tài)，攪拌0.5 h，80 ℃左右保溫2 h，過濾收集50%乙醇提取液，重復(fù)提取2次，合并2次提取液；第3次提取按照培養(yǎng)基殘渣質(zhì)量與提取液體積比1∶10加水提取，加熱至沸騰，攪拌0.5 h，80 ℃左右保溫1 h，過濾收集水提取液。50%乙醇提取液和水提液分別濃縮，濃縮液分別加3倍體積的95%乙醇，靜置過夜，沉淀多糖。合并醇提濃縮沉淀部位和水提濃縮沉淀部位，噴霧干燥，即得到蟬花蟲草粗多糖粉末。

1.2.2 脫蛋白處理

Sevag法脫蛋白：按5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)用去離子水溶解多糖粉末，配制的多糖溶液與Sevag試劑(氯仿∶正丁醇體積比4∶1)按體積比5∶1混合均勻，劇烈振蕩30 min，4 000 r·min-1離心15 min，置于分液漏斗分液除去中間變性蛋白層與下層有機溶液層。重復(fù)上述操作多次直至中間變性蛋白層不再出現(xiàn)為止，每次留樣測定多糖和蛋白的含量。

大孔樹脂法脫蛋白：選用弱極性大孔吸附樹脂AB-8，裝柱(柱徑長50 mm×600 mm)。大孔樹脂預(yù)處理與再生：先用95%乙醇浸泡12 h，用去離子水清洗至無乙醇味，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的鹽酸溶液浸泡4 h，去離子水清洗至pH 6.0左右，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的氫氧化鈉溶液浸泡4 h，去離子水清洗至pH 8.0左右。將蟬花蟲草粗多糖溶液上柱，依次用3倍柱體積的去離子水、20%乙醇和70%乙醇清洗，最后用95%乙醇清洗，洗脫液每250 mL收集1份，每份分別測定其多糖和蛋白含量。

1.2.3 多糖含量測定

采用中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》中的苯酚-硫酸法測定多糖含量。準(zhǔn)確稱取干燥至恒質(zhì)量的無水葡萄糖100 mg，配制成0.1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加入20 mL具塞玻璃試管中，分別加蒸餾水至1.0 mL，再分別加入5%苯酚試劑1 mL混勻，然后垂直液面快速加入濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，混勻，30 ℃水浴反應(yīng)20 min。紫外分光光度計(日本島津，UV-2450)測定490 nm處的吸光度，以葡萄糖濃度和吸光度為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取合適濃度的樣品溶液1 mL，按上述方法測定吸光度，再由回歸方程計算其葡萄糖含量，在此基礎(chǔ)上再乘以葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)0.90，即得樣品的多糖含量。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量[19]。配制牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mg·mL-1，分別吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL標(biāo)準(zhǔn)BSA，添加蒸餾水至1.0 mL，充分搖勻，加入5 mL考馬氏亮藍G-250溶液，放置30 min，然后紫外分光光度計測定595 nm處吸光度。以D595對BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取合適濃度的樣品溶液1.0 mL，按上述方法測定蛋白吸光度，再由回歸方程計算其蛋白含量，計算蛋白去除率[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖的提取得率

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=7.569 3x+0.012 3，R2=0.995 9，其中y為490 nm處的吸光度，x為葡萄糖濃度(mg·mL-1)。經(jīng)苯酚-硫酸法檢測，蟬花子實體培養(yǎng)基殘渣用50%醇提沉淀部分多糖含量為44.7%，水提沉淀部分多糖含量為45.3%，蟬花子實體的培養(yǎng)基殘渣中多糖得率約為14.2%。

2.2 Sevag法和大孔樹脂法脫蛋白效果比較

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=5.325 7x+0.024，R2=0.990 4，其中y為595 nm的吸光度，x為牛血清白蛋白濃度(mg·mL-1)。從圖1可知，蟬花蟲草粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白1次，蛋白去除率約42%，脫蛋白2～6次，蛋白去除率變化不大，為82%～83%；再用大孔樹脂吸附分離的水相部位還能去除剩余蛋白，蛋白總?cè)コ始s98%。蟬花蟲草粗多糖先經(jīng)大孔樹脂洗脫，蛋白去除率約為86%，再用Sevag法脫蛋白1次，粗多糖的蛋白去除率達96%以上。說明Sevag法和大孔樹脂法均能去除蟬花蟲草粗多糖中的絕大多數(shù)游離蛋白，兩種方法結(jié)合去除率更高，達96%以上。此外，大孔樹脂吸附后的多糖顏色由棕褐色變?yōu)辄S褐色，脫色明顯。

A處理組，先用Sevag法對蟬花蟲草粗多糖脫蛋白，再用大孔樹脂法脫蛋白；B處理組，先用大孔樹脂法對蟬花蟲草粗多糖脫蛋白，再用Sevag法脫蛋白圖1 蟬花蟲草粗多糖Sevag法和大孔樹脂脫 蛋白效果

2.3 蟬花蟲草多糖的分離效果

A處理組，先用Sevag法對蟬花蟲草粗多糖脫蛋白6次，再用大孔樹脂法脫蛋白；B處理組，直接用大孔樹脂法對蟬花蟲草粗多糖脫蛋白。分別測定A處理組和B處理組的多糖和蛋白含量。從圖2多糖含量變化曲線可知，A處理組和B處理組的蟬花蟲草粗多糖均能分離獲得水相部位和20%乙醇部位2個主要多糖顯示峰，以及70%乙醇部位的一個多糖小峰，且分離的多糖峰型相似，表明是否進行Sevag法脫蛋白，對多糖組分影響不大，也表明Sevag法脫蛋白對多糖作用溫和。從蛋白含量變化曲線(圖2)可知，B處理組分離的蛋白組分較A處理組多、雜；重疊多糖和蛋白的變化曲線，可見兩處理組分離的主要多糖組分都檢測出少量蛋白，B處理組分離的多糖組分還明顯雜有部分游離蛋白。表明用大孔樹脂法去除粗多糖中的蛋白效果較好，但大孔樹脂對不同蛋白和多糖的吸附程度不同，因此對與多糖吸附性相近的部分游離蛋白尚不能去除，而Sevag法能去除粗多糖中的大部分游離蛋白。

A，A處理組多糖含量變化曲線；B，A處理組蛋白含量變化曲線；C，B處理組多糖含量變化曲線；D，B處理組蛋白含量變化曲線圖2 大孔樹脂對蟬花蟲草粗多糖的分離效果

3 小結(jié)

采用Sevag法和大孔樹脂AB-8吸附法均能去除蟬花蟲草粗多糖中的大部分游離蛋白，蛋白去除率達80%以上，其中Sevag法稍優(yōu)于大孔樹脂法。兩種方法結(jié)合使用對蟬花蟲草粗多糖中蛋白去除效果更為理想。先用Sevag法后用大孔樹脂法，或者先用大孔樹脂法后用Sevag法，就大孔樹脂水相洗脫部位多糖的分離而言，蛋白去除率均達96%以上。大孔樹脂還具有較好的分離效果和脫色效果，初步分離獲得水相部位和20%乙醇部位的蟬花蟲草多糖，多糖組分中檢測到少量蛋白的重疊峰，推測這兩個多糖組分中存在糖蛋白。綜合分析，蟬花蟲草粗多糖脫蛋白工藝采用先經(jīng)Sevag法脫蛋白2～3次，再用大孔樹脂AB-8吸附分離，或先大孔樹脂AB-8吸附分離獲得不同多糖組分，再用Sevag法輔助脫蛋白1～2次為佳，兩種組合處理均能達到理想的去除蛋白和多糖初步分離效果。

粗多糖脫蛋白除雜工藝對下一步多糖高效分離純化至關(guān)重要。Sevag法是一種認(rèn)可的多糖脫蛋白常用方法，蟬花蟲草粗多糖單獨采用Sevag法脫蛋白一般須進行6～7次重復(fù)操作，中間變性蛋白層才基本不見，但操作人員易受Sevag試劑危害[18]。Sevag法和大孔樹脂吸附法組合使用可以減少Sevag法脫蛋白次數(shù)及Sevag試劑用量。此外，大孔樹脂AB-8價格低廉，可反復(fù)再生多次使用，成本低，洗脫溶劑乙醇毒性也低，而且大孔樹脂吸附柱一次性處理能力較大，兩種方法結(jié)合有利于獲得大量的純度較好的蟬花蟲草多糖，可為多糖的進一步分離純化及其生理活性功能研究打下良好的基礎(chǔ)。