劉可，王遠(yuǎn)宏，常若葵，劉慧芹，李二峰，張斌

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384)

土壤是土地資源的重要組成部分，是人類賴以生存的基本的和重要的自然資源。土壤真菌及其群落結(jié)構(gòu)組成對(duì)生態(tài)系統(tǒng)可產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的平衡也具有重要作用。真菌是土壤微生物的主要組成部分，參與有機(jī)物質(zhì)分解。

玉米秸稈在自然條件下腐解速度緩慢，時(shí)間從3個(gè)月到半年不等，若直接焚燒，不僅危害公眾健康，還造成環(huán)境污染。為解決這一問題，各國學(xué)者進(jìn)行了不懈努力，秸稈腐熟技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其原理主要是利用真菌在高溫(40～60 ℃)下有效分解作物秸稈中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素[1]，使秸稈中所含的有機(jī)質(zhì)及磷、鉀等元素成為植物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，并產(chǎn)生大量有益微生物，刺激作物生產(chǎn)，提高土壤有機(jī)質(zhì)，改善作物品質(zhì)。當(dāng)溫度超過65 ℃時(shí)，真菌的活躍度降低，秸稈腐熟作用下降[2]。本實(shí)驗(yàn)從土壤中提取和鑒定真菌DNA，并將得到的真菌進(jìn)行耐高溫實(shí)驗(yàn)和纖維素降解實(shí)驗(yàn)，旨在篩選出可用于秸稈腐熟的真菌菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

土壤中提取黑曲霉(Aspergillusniger)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、土曲霉(Aspergillusterreus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、青霉(Penicilliumsp. BAB-1995)等真菌，均保存于天津農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試儀器

全自動(dòng)高壓滅菌鍋(廈門致微)，HB.B11.600-S-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn))，MJP-150霉菌培養(yǎng)箱(上海培因)，TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀)，超凈工作臺(tái)(蘇州安凈)，梯度PCR儀(美國Bio-Rad)，智能恒溫振蕩器(德國Bottmingen)，電泳儀(日本Advance)，HNY-2102C立式搖床(天津歐諾)，恒溫恒濕人工氣候培養(yǎng)箱(德國Climacell)，電熱恒溫干燥箱(天津泰斯特)，精密電子天平(美國Ohaus)。

1.1.3 供試材料

PDA固體及液體培養(yǎng)基，用于真菌培養(yǎng)；纖維素酶鑒別固體培養(yǎng)基，用于纖維素酶測(cè)定。玉米秸稈樣品，采集于天津市武清區(qū)及寶坻區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 真菌收集

從天津、內(nèi)蒙古、甘肅、山西、浙江、廣西、貴州等地的發(fā)病作物根際采集土樣，土樣采回后于4 ℃冰箱中保存。將采集得到的土樣置于室溫風(fēng)干，過60目篩后，取5 g土樣，溶于100 mL的無菌生理鹽水(1%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))中，28 ℃、200 r·min-1充分振蕩30 min。取搖好的懸濁液，10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀釋后分別涂布于PDA平板(每150 mL PDA加入100 μL硫酸鏈霉素，防止細(xì)菌污染)上，每個(gè)平板涂布200 μL，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取真菌單菌落，進(jìn)一步純化培養(yǎng)。

1.2.2 真菌鑒定

將已長(zhǎng)滿真菌的平板，用無菌藥匙刮下菌絲放置在滅菌的研缽中，加入適量液氮研磨成粉末狀。用Solarbio公司真菌基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)：D2300)提取真菌DNA，取1 μL DNA上清液作為模板，引物使用ITS1和ITS4，序列分別為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′。PCR體系(25 μL)：模板1 μL，dNTP 0.3 μL，10×緩沖液2.5 μL，引物(ITS1和ITS4)各1 μL，Taq酶0.15 μL，ddH2O 19.05 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，重復(fù)40次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

PCR所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將拼接序列在NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.2.3 耐高溫實(shí)驗(yàn)

將得到的31株真菌進(jìn)行編號(hào)，用打孔器從真菌PDA平板重新轉(zhuǎn)接真菌，置于45 ℃和50 ℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，7 d內(nèi)觀察并記錄生長(zhǎng)情況，第7天進(jìn)行拍攝記錄。

1.2.4 纖維素酶實(shí)驗(yàn)

利用平板透明圈法[3]，取新鮮培養(yǎng)的真菌培養(yǎng)液，使用牛津杯分別接種到纖維素酶鑒別培養(yǎng)基平板上，42 ℃培養(yǎng)，定時(shí)觀察真菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，以及透明圈的形成情況，同時(shí)測(cè)量透明圈直徑，實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.2.5 秸稈腐熟實(shí)驗(yàn)

經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)，將篩選出的5株真菌制成PDA菌液。選取粗細(xì)與長(zhǎng)度接近的完整玉米秸稈，將其截成3～5 cm小段。稱取50 g秸稈小段放入40目尼龍袋中，編號(hào)，將樣品置85 ℃烘干處理6 h，準(zhǔn)確稱量并記錄每袋質(zhì)量。將上述秸稈樣品取出，放入方形玻璃器皿中，分別倒入前述5種樣品菌液，同時(shí)設(shè)置清水對(duì)照(CK)，放在恒溫恒濕人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度設(shè)置為50 ℃，相對(duì)濕度70%，密封保存。分別在實(shí)驗(yàn)10、20、30 d取出處理樣品，放置85 ℃烘箱中烘干6 h，準(zhǔn)確稱量并記錄每袋質(zhì)量。分別按10、20、30 d腐解時(shí)間計(jì)算秸稈失重率[4-5]。每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫菌株篩選

將重新轉(zhuǎn)接的31株真菌在MJP-150霉菌培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)7 d，篩選出可以生長(zhǎng)的真菌。將選出的真菌再次接種，在45 ℃和50 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第7天觀察并記錄生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有14號(hào)、15號(hào)、23號(hào)、30號(hào)和37號(hào)菌株可以在50 ℃的高溫下生長(zhǎng)。其中，14號(hào)分離自天津北辰區(qū)核桃林，15號(hào)分離自內(nèi)蒙古包頭玉米地，23號(hào)和37號(hào)分離自河北滄州黃瓜田，30號(hào)分離自內(nèi)蒙古草坪。

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

取14、15、23、30、37號(hào)菌株進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)，結(jié)果顯示，37號(hào)菌株與灰蓋鬼傘蘑菇(Coprinopsiscinerea)親緣關(guān)系較近，14號(hào)、15號(hào)、23號(hào)、30號(hào)菌株與煙曲霉(Aspergillusfumigatus)親緣關(guān)系較近。37號(hào)菌株、14號(hào)菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖1所示。

2.3 菌株的纖維素降解活性

如圖2所示，14號(hào)、15號(hào)、23號(hào)、30號(hào)菌株在纖維素酶鑒別培養(yǎng)基中均能夠正常生長(zhǎng)，并形成透明圈，但4株菌產(chǎn)生的透明圈較小(表1)，且顏色較淡。4株菌中，14號(hào)和23號(hào)菌株可以使纖維素酶鑒別培養(yǎng)基顏色加深。

表1 各菌株在纖維素酶鑒別培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的菌落直徑及透明圈直徑

2.4 菌株對(duì)秸稈的腐熟效果

2.4.1 秸稈腐解過程中的顏色變化

處理前玉米秸稈外觀顏色都為青色。實(shí)驗(yàn)3 d可以看到明顯的菌絲生長(zhǎng)在秸稈表面；7～10 d秸稈明顯變軟，顏色變深，為黃褐色，而對(duì)照為淺黃色；20 d后秸稈數(shù)量變少，部分秸稈腐熟，成為褐色液體，并發(fā)出腐爛氣味；30 d后，接種菌劑處理的秸稈顏色變?yōu)楹谏?，而?duì)照為褐色。從表2可以看出，在相同時(shí)間內(nèi)，接菌劑和未處理的秸稈顏色變化存在差異，接種菌劑的秸稈顏色變化比對(duì)照快，外觀顏色變化為青色→黃褐色→褐色→深褐色→灰黑色，變化速度較快。

圖1 37號(hào)與14號(hào)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 各菌株在纖維素酶鑒別培養(yǎng)基上7 d的生長(zhǎng)情況及形成的透明圈

處理施用前10 d20 d25 d30 d14青色黃褐色褐色深褐色灰黑色15青色黃褐色褐色深褐色灰黑色23青色黃褐色褐色深褐色灰黑色30青色黃褐色褐色深褐色灰黑色37青色黃褐色褐色深褐色灰黑色CK青色黃色淺黃色黃褐色褐色

2.4.2 秸稈腐解過程中的失重率變化

如表3所示，處理10 d，14號(hào)、15號(hào)、23號(hào)和30號(hào)的失重率無顯著差異，均顯著高于CK，但37號(hào)與CK間無顯著差異。處理20 d，接種真菌菌株的各處理失重率均顯著高于CK，接菌處理中，15號(hào)失重率最高，且顯著高于30號(hào)和37號(hào)。處理30 d，接種真菌菌株的各處理失重率同樣均顯著高于CK，接菌處理中，以15號(hào)失重率最高，且顯著高于其他處理。

表3 秸稈腐解過程中的失重率 %

3 小結(jié)

本研究初步篩選出5株能夠腐熟秸稈的真菌菌株，分屬于煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和灰蓋鬼傘蘑菇(Coprinopsiscinerea)。將各菌株與秸稈混合進(jìn)行腐熟實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)來自內(nèi)蒙古包頭玉米地的15號(hào)煙曲霉(Aspergillusfumigatus)對(duì)秸稈的降解效果最好，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)觀察，秸稈已基本降解，變得疏松，呈黑褐色或黑色，pH穩(wěn)定在7.5左右。