孫亞麗，雷建園，呂茉琦，葛 攀，李意新，王世捷

(1.陜西省人民醫(yī)院病理科，陜西西安 710068；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系，陜西西安 710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西西安 710061)

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球10%～15%已婚夫婦患有不孕不育，其中男性原因引起的不育約占50%[1]。而50%～65%的男性不育病因和發(fā)病機(jī)制不明，稱為特發(fā)性男性不育癥[2]。非梗阻性無精癥(non-obstructive azoospermia，NOA)是特發(fā)性男性不育的重要類型之一，由于病因不明，給臨床診療帶來了很大困難，目前尚缺乏根本有效的預(yù)防和治療手段[3]。

關(guān)于NOA的病因和發(fā)病機(jī)制有很多學(xué)說，其中遺傳學(xué)說是科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)之一[2-3]。人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是一種高度多態(tài)性的人類基因系統(tǒng)，定位于第6染色體短臂。研究顯示HLA基因的多態(tài)性不僅和人類進(jìn)化、親緣關(guān)系密切有關(guān)，而且其高度復(fù)雜性和多態(tài)性也使其與多種疾病的易感性密切相關(guān)[4-5]。HLA-A屬于HLA I類基因，MIURA等[6]報(bào)道顯示日本人群中HLA-A33基因高表達(dá)與日本男性NOA發(fā)生密切相關(guān)， 而ALEKSOVSKI等[7]研究顯示HLA-A26、A28基因高表達(dá)與前南斯拉夫男性NOA發(fā)生密切相關(guān)。ZHOU等[8]也初探了HLA-A基因多態(tài)性與中華漢族NOA的相關(guān)性。

眾所周知，基因的多態(tài)性常具有民族、人種和地域差異[8-9]，回族是中國人口較多的一個(gè)少數(shù)民族,陜西回族又是回族的重要支脈。因此，本研究依托的陜西省特有的人口資源優(yōu)勢，利用先進(jìn)的聚合酶鏈反應(yīng)-直接測序(polymerase chain reaction sequence-based typing，PCR-SBT)技術(shù)，探索HLA-A基因在陜西回族NOA人群中的分布及其與NOA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1研究對象NOA病例選自2012年1月至2017年5月期間在西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心、西安交通大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)中心以及西京醫(yī)院生殖中心等地就診的20～42歲男性不育患者，均系回族且排除隱睪、精索靜脈曲張、梗阻性無精癥、染色體異常以及全身性疾病等引起的繼發(fā)性不育。對照組為有正常生育史的健康陜西回族男性，年齡20～40歲。本研究方案經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，每位研究對象均被告知研究目的、方法和意義，并簽署知情同意書。

本研究最終入選59例陜西回族NOA患者和61例陜西回族健康對照。其中NOA病例組平均年齡(31.63±3.92)歲，正常健康對照組年齡(30.75±3.97)歲,兩組之間無明顯年齡差異(P=0.228)。此外，HLA-A基因在NOA病例組(P=0.4777)和對照組(P=0.3562)人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

1.2靜脈血采集與全血基因組DNA提取采集病例組與對照組每人2 mL外周靜脈血于乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝管中,-20℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?全血基因組DNA提取過程嚴(yán)格參照全血DNA提取試劑盒說明書(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行。

1.3PCR-SBT方法進(jìn)行HLA-A位點(diǎn)基因分型應(yīng)用PCR-SBT對HLA-A位點(diǎn)進(jìn)行基因多態(tài)性檢測。具體方法為：首先對HLA-A基因的第2 外顯子和第3外顯子進(jìn)行基因擴(kuò)增，整個(gè)基因擴(kuò)增過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行(SeCoreTM， Invitrogen)；其次將得到的PCR產(chǎn)物純化；然后利用 ABI-3730XL DNA測序儀進(jìn)行序列測定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Arlequin 3.5軟件(Laurent Excoffier，Zoological Institute，University of Bern，Switzerland)對HLA-A基因位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測。采用PowerStat Version 1.2軟件 (Promega Corporation，Madison，WI，USA)計(jì)算HLA-A位點(diǎn)的多項(xiàng)基因?qū)W參數(shù)包括期望雜合度(heterozygotes,Het)、觀察純合度(homozygotes,Hom)、多態(tài)信息量(polymorphism information content，PIC)、個(gè)體識別率(power of discrimination，PD) 和非父排除率(probability of paternity exclusion，PPE)等。采用SPSS 17.0 for Windows 軟件計(jì)算HLA-A位點(diǎn)的等位基因頻率。采用χ2檢驗(yàn)和Fisher’s檢驗(yàn)檢測病例組與對照組HLA-A位點(diǎn)的基因頻率差異。最后，通過計(jì)算比值比(odds ratio,OR)及95%可信區(qū)間(95% confidence interval，CI)評估基因易感性風(fēng)險(xiǎn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HLA-A基因位點(diǎn)的多態(tài)性參數(shù)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、PIC、PD和PPE，這些基因參數(shù)信息用來評估基因多態(tài)性。當(dāng)PIC值>0.5， PD值>0.8以及PPE值>0.5，均表明此基因是高度多態(tài)性的。

由表1可見，HLA-A基因在NOA病例和對照組人群中的PIC、PD和PPE值均高于臨界值，說明HLA-A基因在NOA病例組和對照組人群中分別呈高度多態(tài)性。

表1HLA-A基因在NOA病例和健康對照人群中的基因多態(tài)性參數(shù)

組別Hom(%)Het(%)PICPDPPENOA組6.8093.200.890.950.86對照組6.6093.400.880.970.87

2.2HLA-A基因型在NOA病例組和對照組的分布情況由表2可見，病例組和對照組均檢測到19種HLA-A基因型。其中基因型頻率>5%者：病例組有9種，從高到低依次分別為HLA-A*11∶01 (20.3%)，A*24∶02 (14.4%),A*26∶01 (10.2%)，A*02∶01 (9.3%)，A*01∶01 (7.6%)，A*03∶01(5.9%)，A*02∶06(5.1%)，A*02∶07(5.1%) 和A*31∶01 (5.1%)；對照組有7種，從高到低依次分別為HLA-A*11∶01 (22.1%)，A*02∶01 (13.9%)，A*24∶02 (12.3%)，A*02∶07(7.4%)，A*02∶06(6.6%)，A*01∶01 (5.7%)和A*31∶01 (5.7%)。

2.3HLA-A基因型分布與NOA易感性之間的關(guān)系多數(shù)HLA-A位點(diǎn)的等位基因頻率在NOA病例與對照組中未見明顯差異。但HLA-A*26∶01 等位基因在NOA組的頻率明顯高于對照組(表2)，即HLA-A*26∶01 基因型具有較高的NOA患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=3.340，95%CI:1.045～10.670)。此外，為了和以前的研究對比，我們依據(jù)SCHREUDER等[10]的研究方法把高分辨率HLA-A基因型轉(zhuǎn)換成為血清型分型，最終21種不同類型的HLA-A高分辨率基因型分轉(zhuǎn)換成12種血清型，如表3所示，大多血清型在病例組和對照組之間沒有差異，但A26血清型具有較高的患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=3.340，95%CI:1.045～10.670)。

表2高分辨率HLA-A位點(diǎn)等位基因在NOA病例組與對照組中的分布

HLA-A基因型對照組(n=22 等位基因)例數(shù)AF (%)NOA組(n=118 等位基因)例數(shù)AF (%)P值OR (95%CI)01∶0175.797.60.5571.356(0.488～3.769)02∶011713.9119.30.2660.635(0.284～1.420)02∶0343.332.50.7350.770(0.169～3.514)02∶0686.665.10.6270.763(0.257～2.271)02∶0797.465.1— —02∶09——10.8— —03∶0164.975.90.7291.219(0.397～3.741)03∶0210.8——— —11∶012722.12420.30.7340.898(0.484～1.669)11∶0210.810.80.7431.034(0.064～16.727)24∶021512.31714.40.6301.201(0.570～2.531)24∶8910.810.80.7431.034(0.064～16.727)26∶0143.31210.20.032*3.340(1.045～10.670)29∶0110.810.80.7431.034(0.064～16.727)29∶02——10.8— —30∶0164.954.20.8010.855(0.254～2.882)31∶0175.765.10.8230.880(0.287～2.700)32∶0121.621.70.6761.034(0.143～7.466)33∶0110.810.80.7431.034(0.064～16.727)33∶0343.343.40.6201.035(0.253～4.238)68∶0110.8——— —

AF：等位基因頻率;OR:比值比;CI:可信區(qū)間；*P<0.05，病例組和對照組有顯著差異。

表3 HLA-A位點(diǎn)血清型分型在NOA病例組與對照組中的分布[例(%)]

OR：比值比;CI：可信區(qū)間。

3 討 論

NOA即原發(fā)性無精癥，是一種特殊類型的睪丸生殖病理損害。目前研究熱點(diǎn)集中在從分子角度闡明NOA發(fā)病機(jī)制[11]，從而達(dá)到防控NOA的目的。

本研究首次在陜西回族人群中利用先進(jìn)的PCR-SBT技術(shù)探索HLA-A基因在NOA患者中的多態(tài)性分布及其與NOA之間的易感聯(lián)系。研究結(jié)果顯示：與對照組相比，HLA-A*26∶01 基因型在NOA組高表達(dá)，也就是說，HLA-A*26∶01 基因型與陜西回族人群NOA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯關(guān)聯(lián)。此研究結(jié)果與ALEKSOVSKI等[7]在前南斯拉夫NOA患者中的研究結(jié)果一致；這一現(xiàn)象并沒有在漢族NOA人群中發(fā)現(xiàn)[8]。目前關(guān)于HLA-A與男性不育相關(guān)性的研究結(jié)果并不一致：MIURA等[6]報(bào)道顯示日本人群中HLA-A33基因高表達(dá)與日本男性NOA發(fā)生密切相關(guān)，而ALEKSOVSKI等[7]研究顯示HLA-A26、A28基因高表達(dá)與前南斯拉夫男性NOA發(fā)生密切相關(guān)，ZHOU[8]、NORDLANDER[12]和MARTIN-VILLA等[13]的研究卻沒有發(fā)現(xiàn)HLA-A與男性不育易感有關(guān)。這些不一致的研究結(jié)果可能歸因于HLA分型方法、樣本尺寸、樣本種族以及地域的差異。

HLA 分型方法有多種，HLA低分辨率分型(即血清型分型)的方法包括序列特異性寡核苷酸探針分型(PCR-SSOP,DNA amplification with specific oligonucleotide probes)以及序列特異性引物分型(PCR-SSP,DNA amplification with sequence-specific primers)。與以往實(shí)驗(yàn)中采用的低分辨率分型不同，我們這次采用PCR-SBT對 HLA等位基因進(jìn)行高分辨率分型，是目前HLA 分型最直接和最準(zhǔn)確的方法[8]。為了和以往的低分辨率研究做比較研究，我們利用SCHREUDER等[10]的研究方法把高分辨率HLA-A基因型轉(zhuǎn)換成為低分辨率的血清型分型。不管是高分辨率基因分型還是低分辨率血清學(xué)分型，結(jié)果均顯示HLA-A*26∶01 基因型(相當(dāng)于HLA-A26血清型)與陜西回族人群NOA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯關(guān)聯(lián)。

此外，本研究的基因參數(shù)如純合度(Ho)、He、PIC、PD和PPE均顯示HLA-A基因在NOA病例組和對照組呈現(xiàn)多態(tài)性分布，而且在兩組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。另一方面，本研究人群均排除了隱睪、精索靜脈曲張、梗阻性無精癥、染色體異常以及全身性疾病等引起的繼發(fā)性不育，且病例組和對照組均選用在陜西地區(qū)居住的回族男性，進(jìn)一步排除了種族差異和地理環(huán)境對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

綜上，本結(jié)果初步證實(shí)了HLA-A*26∶01 基因型(相當(dāng)于血清型HLA-A26)與陜西回族人群NOA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。然而，后續(xù)仍需要在更大的人群樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，并且需要進(jìn)一步探索其調(diào)控生精的分子機(jī)制，為闡明NOA發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供有價(jià)值的線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。