段曉穎，范梨穎，馬秋瑩，牛曉靜，郭 嬌，徐立然

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 ，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 3.商丘市中醫(yī)院，河南 商丘 476000)

靈芝為多孔菌科靈芝屬，又稱瑞草、靈芝草，是靈芝屬藥食兩用真菌，在我國已有2 000多年的藥用歷史，有補(bǔ)氣安神、止咳平喘的療效，常用于心神不寧、失眠心悸、肺虛咳喘、虛勞短氣等。此外，大量臨床應(yīng)用表明靈芝還有抗腫瘤，保肝解毒，防治高血脂、中風(fēng)、心血管疾病，抗衰老，抗神經(jīng)衰弱等功效[1-5]。研究表明：靈芝能夠刺激機(jī)體中淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力和吞噬細(xì)胞的吞噬能力，從而產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用[6-7]。本研究以靈芝中總?cè)坪挽`芝酸A為考察指標(biāo)，通過均勻設(shè)計(jì)和單因素實(shí)驗(yàn)研究總?cè)频淖罴烟崛?、純化工藝?/p>

1 藥品、試劑與儀器

靈芝藥材，批號140203，產(chǎn)地安徽。熊果酸，純度為HPLC≥98%，中國食品藥品檢定研究院提供，批號110742-200517；靈芝酸A，純度為HPLC≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號140324；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純。大孔吸附樹脂HPD400，滄州寶恩化工有限公司產(chǎn)品；Aglient 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品；TU-1800PC紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；LXJ-ⅡB離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；HK 250科導(dǎo)臺式超聲波清洗器，上海漢克科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Sartorius CP225D電子天平，德國賽多利斯公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 靈芝總?cè)铺崛」に囇芯?/h3>

2.1.1 靈芝酸A含量測定方法研究

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A) 、0.2%磷酸水(B)，檢測波長 254 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量 10μL，流速 1.0 mL/min，信號采集時間 90 min。梯度洗脫程序?yàn)? 0-30 min, 33%～34% A；30-60 min, 34%～80% A；60-70 min, 80%～100% A；70-75 min, 100%～33% A；75-90 min， 33% A。

對照品溶液的制備：精密稱取靈芝酸A對照品 10.06 mg，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：取靈芝粉末1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入乙醇 50 mL,稱定質(zhì)量?；亓魈崛?60 min，放冷后稱量，乙醇補(bǔ)足差重。濾過，取續(xù)濾液，即得。

靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.006 g/L的對照品儲備液0.05,0.10,0.25,0.50,0.75,1.00,1.25 mL置于5 mL 的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按照上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計(jì)算得回歸方程為y=900.76x+5.073 0,r=0.999 7。結(jié)果表明：靈芝酸A峰面積和含量在0.100 6～2.515 0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

含量測定：取供試品和對照品各10 μL按色譜條件進(jìn)樣，記錄各樣品中靈芝酸A峰面積，計(jì)算靈芝酸A百分含量。

2.1.2 總?cè)坪繙y定

參照2015版《中國藥典》。

對照品溶液的制備：精密稱取熊果酸對照品2.13 mg，加無水乙醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：取靈芝粉末約1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入乙醇50 mL, 稱定質(zhì)量；回流提取 60 min，放冷后稱量質(zhì)量；乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量；濾過，取續(xù)濾液，即得。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密量取對照品溶液0.2 ，0.3，0.4，0.6，0.8 mL，置10 mL的具塞試管中；水浴蒸干；加 0.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 g/L 香草醛-冰乙酸溶液和1.0 mL的高氯酸溶液，搖勻；65 ℃水浴 45 min；取出，立即放入冰水浴中；加入5.0 mL 冰乙酸溶液，搖勻后放置；15 min后以相應(yīng)試劑為空白，在 548 nm 處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，熊果酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計(jì)算得回歸方程為：Y=30.009X+0.099 6,r=0.999 5。結(jié)果表明：吸光度和熊果酸在0.006 7～0.026 6 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

含量測定：精密量取供試品溶液 0.5 mL，同對照品的測定方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總?cè)坪俊?/p>

2.1.3 靈芝提取次數(shù)考察

準(zhǔn)確稱取靈芝粉末 30.0 g，加入10倍量體積分?jǐn)?shù)為 850 mL /L的乙醇，提取 3 次，每次 2 h，以總?cè)妻D(zhuǎn)移率為指標(biāo)，考察提取次數(shù)對總?cè)铺崛×康挠绊?。結(jié)果顯示：提取1次、2次、3次,總?cè)妻D(zhuǎn)移率依次為65.52%、75.45%、83.31%。因此選擇提取次數(shù)為3次。

2.1.4 均勻?qū)嶒?yàn)優(yōu)選提取工藝

表1 總?cè)铺崛」に嚲鶆蛟O(shè)計(jì)因素水平表

表2 總?cè)铺崛【鶆蛟O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)指標(biāo)對提取目的重要性程度，給予不同的權(quán)重系數(shù)，總?cè)茷?.6，靈芝酸A為0.4，再進(jìn)行加權(quán)求和，綜合評分以各指標(biāo)的轉(zhuǎn)移率來計(jì)算。利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸分析，根據(jù)各回歸方程的回歸系數(shù)、F值及其顯著性檢驗(yàn)，選出最優(yōu)方程：Y=74.052+0.216X1-0.026X1X2+0.001X1X3+0.014X2X3-0.001X3。顯著水平P=0.004，相關(guān)系數(shù)R=0.998，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)R=0.994。表明該回歸方程擬合度良好，因素顯著。對該回歸方程進(jìn)行規(guī)劃求解，優(yōu)選的最佳工藝為：加體積分?jǐn)?shù)為 900 mL /L的乙醇 8 倍量，提取 100 min。

2.1.5 最佳工藝的驗(yàn)證

稱取靈芝粗粉 3 份，每份 100 g，按照最佳提取工藝提取，測定提取液中總?cè)坪挽`芝酸A含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果：該工藝條件下總?cè)频霓D(zhuǎn)移率分別為91.82%、89.19%、89.49%，平均轉(zhuǎn)移率為90.17%；靈芝酸A的轉(zhuǎn)移率分別為86.37%、87.10%、83.73%，平均轉(zhuǎn)移率為85.73%。加權(quán)處理后平均轉(zhuǎn)移率為88.39%，大于規(guī)劃求解推薦值84.97%，說明該提取工藝穩(wěn)定性較好。

2.2 靈芝總?cè)拼罂讟渲兓に囇芯?/h3>

2.2.1 均勻?qū)嶒?yàn)優(yōu)選上樣工藝

均勻設(shè)計(jì)因素水平表：以吸附率為考察指標(biāo)，分別考察上樣液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/L)、上樣流速(mL/min)、上樣液pH值和徑高比4個因素對總?cè)萍兓挠绊?，因素水平表見?。

表3 總?cè)萍兓鶆蛟O(shè)計(jì)因素水平表

供試液的制備：稱取靈芝藥材粗粉 300 g，按照上述最佳提取工藝進(jìn)行提取，合并提取液，減壓濃縮，用乙醇配制不同上樣液，按照U9(95)均勻?qū)嶒?yàn)安排表進(jìn)行上樣，收集流出液，按 2.1.2項(xiàng)下方法測定吸附后溶液中總?cè)坪浚?jì)算吸附率%。結(jié)果見表4。

表4 均勻設(shè)計(jì)安排表及結(jié)果

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸分析，選出最優(yōu)方程為：Y=174.884-5.311X1-0.679X3-3.448X4+0.799X1X2+0.166X1X4-3.271X2X2。顯著水平P=0.004，相關(guān)系數(shù)r=0.999，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)r=0.994。表明該回歸方程擬合度良好，對該方程規(guī)劃求解，優(yōu)選的最佳工藝為：上樣液質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.52 g/L，上樣流速1.0 mL/min，上樣液pH值為8，徑高比1∶11。

2.2.2 最佳上樣工藝的驗(yàn)證

按照上述優(yōu)選出的工藝參數(shù)平行3份進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果吸附率分別為99.36%、99.41%、99.39%，RSD值為0.03%，表明工藝穩(wěn)定性良好。

2.2.3 泄露曲線

取已處理好的HPD-400大孔吸附樹脂濕法裝柱，使徑高比為1∶11，取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.52 g/L，pH=8的上樣液上樣，控制上樣流速為 1.0 mL/min，分段收集洗脫柱液。每 10 毫升收集1份，共收集20份，測定接收液中總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)，以上樣體積為橫坐標(biāo)，泄露率為縱坐標(biāo)繪制泄露曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 泄露曲線

從第7份接收液開始已經(jīng)有總?cè)菩孤?，但此時泄露率僅為1.98%，相對于上樣量仍然很小，至第12份接收液泄露液質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇增大，因此選擇泄露液濃度急劇增大前上樣，即110 mL。

2.2.4 洗脫工藝優(yōu)選

洗脫流速考察：按上述確定的吸附條件，取上樣液分別通過3根相同的HPD-400樹脂柱，進(jìn)行動態(tài)吸附，用3 BV的乙酸乙酯分別以1.0 ，2.0 ，3.0 mL/min的洗脫流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總?cè)坪?，?jì)算解吸率。結(jié)果見圖2。

圖2 總?cè)萍兓疵摿魉倏疾烨€

洗脫曲線：按照上述所確定的吸附和洗脫條件，進(jìn)行上柱、吸附和洗脫，每25毫升收集 1 份，連續(xù)接取洗脫液。對每份洗脫液進(jìn)行測定，以流出液體積為橫坐標(biāo)，以每份中總?cè)频慕馕?為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 洗脫曲線

由圖3可看出，當(dāng)洗脫劑用量為 150 mL時，洗脫液中總?cè)平馕室呀咏鼮榱?，總?cè)埔褞缀醣幌疵撓聛?，因此確定洗脫劑用量為150 mL，即3.4 BV。

2.2.5 總?cè)谱罴压に囼?yàn)證

按照上述篩選的工藝進(jìn)行上樣吸附和解吸，收集流出液，測定總?cè)坪俊＝Y(jié)果顯示：3次含量分別為54.80%、53.95%、55.78%，平均含量為54.84%，達(dá)到50%以上，該工藝穩(wěn)定、可行。

3 討 論

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，比較HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、X-5、HPD-BJQH、S-8樹脂對靈芝三萜的純化，結(jié)果顯示：D101、 HPD-400、 AB-8、X-5這4種非極性或弱極性樹脂的吸附率和比吸附量均較大。通過對該4種樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附、解吸動力學(xué)考察，結(jié)果顯示：HPD-400型大孔樹脂的吸附率和解吸率最高，且在2 h左右達(dá)到吸附平衡，較其他樹脂更早達(dá)到飽和吸附，縮短吸附時間。因此，選擇HPD-400作為總?cè)萍兓脴渲?/p>

在總?cè)频募兓に囇芯恐?，大都采用水溶液進(jìn)行上樣吸附，而三萜屬脂溶性成分，靈芝三萜提取濃縮液加水溶解后出現(xiàn)沉淀，不易被大孔樹脂吸附，損失較大，上樣液用900 mL/L乙醇配制。在選擇洗脫劑時,對非極性樹脂,要求采用對化合物有較好溶解度且要有較好的極性,這樣可得到高濃度的洗脫液,常用的溶劑是水、低級醇、丙酮、乙酸乙酯等,由于上樣吸附時采用的溶劑是 900 mL/L 乙醇,因此采用比乙醇極性低的溶劑如丙酮、乙酸乙酯進(jìn)行解吸,兩者都具有較好的解吸能力,但丙酮為易制毒試劑，故選擇乙酸乙酯為洗脫劑進(jìn)行洗脫[10-12]。