陳燕 張兆輝 張琦 王翠芳

Furin在神經(jīng)系統(tǒng)有豐富的表達(dá)并參與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、血管生長(zhǎng)因子(VEGF)的成熟過(guò)程[1]。在BDNF的成熟過(guò)程中Furin的切割在調(diào)控形成具有生物活性的BDNF過(guò)程中起關(guān)鍵作用[2]。并且我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Furin在急性缺血缺氧病理過(guò)程中介導(dǎo)了星形細(xì)胞BDNF細(xì)胞內(nèi)的分泌成熟過(guò)程[3]。BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在大腦皮層、海馬等部位含量較豐富，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在很多病理狀態(tài)下神經(jīng)元分泌的BDNF的表達(dá)水平發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察在海馬神經(jīng)元糖氧剝離后不同時(shí)間點(diǎn)Furin、BDNF的表達(dá)水平變化以明確Fuirn是否介導(dǎo)的BDNF的表達(dá)水平變化過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 材料 新生SD大鼠1～2 d齡，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Furin、BDNF抗體及GFAP抗體(abcam)，多聚賴氨酸(sigma),Neurobasal 培養(yǎng)基、B27及D-Hank,s液(Gibco公司)。

1.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 將新生24～48 h的SD乳鼠浸入75%冰浴乙醇消毒，取出全腦，在解剖顯微鏡下在小腦端輕輕撥開大腦皮層露出新月形海馬，去軟腦膜、血管網(wǎng)后將海馬組織剪成小組織塊，靜止2 min后去上清，然后加入0.125%胰蛋白酶消化5 min,胎牛血清終止消化，細(xì)胞篩過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液；離心后加種植培養(yǎng)基(90% DMEM-F12+10%FBS)重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種于培養(yǎng)皿；24 h后將種植培養(yǎng)基全量換成維持培養(yǎng)基(97% Neruobasal 1%B27+1% l-谷氨酰胺)，以后每3d維持培養(yǎng)基半量換液。

1.3 OGD模型建立 神經(jīng)元培養(yǎng)到第7 d，去培養(yǎng)基加不含血清的無(wú)糖DMEM,將細(xì)胞培養(yǎng)板移入潮濕密閉容器，持續(xù)泵入95%N2和5%CO2混合氣體，37恒溫處理3 h，低氧誘導(dǎo)后的海馬神經(jīng)元在再灌注0，12，24、48、72 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞總蛋白。

1.4 蛋白免疫印跡檢測(cè)Furin、BDNF蛋白表達(dá)水平 以再灌注0 h為對(duì)照組，將已收集的低氧誘導(dǎo)后的海馬神經(jīng)元總蛋白進(jìn)行蛋白定量(BAC assay，按試劑盒說(shuō)明操作)，用12%SDS-PAGE分離目的蛋白Furin、BDNF,以管家蛋白GAPDH校正上樣量；將需檢測(cè)蛋白標(biāo)本上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵抗體。其中各抗體稀釋度依次為抗Furin抗體，抗 BDNF多克隆抗體(1∶1 000)，二抗(1∶3 000)，內(nèi)參GAPDH(1∶5 000)；ECL發(fā)光試劑發(fā)光、顯影、定影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像；檢測(cè)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

以氧糖剝離再灌注0 h為基數(shù)1，對(duì)不同再灌注時(shí)間點(diǎn)BDNF、Furin總蛋白的灰度值比值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化比較。從圖1中可見BDFN的表達(dá)水平隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。在最初12 h的再灌注時(shí)間內(nèi)BNDF的表達(dá)水平下降約30%，再灌注24 h下調(diào)約50%，48 h下調(diào)約70%，72 h下調(diào)約70%，與對(duì)照組比較有明顯差異(12 h,P=0.04;24 h,P=0.04；48 h，P=0.003；72 h,P=0.001)。從圖2中可見Furin的表達(dá)水平隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。在最初12 h的再灌注時(shí)間內(nèi)Furin的表達(dá)水平上調(diào)約1.3倍,與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(12 h,P=0.08)，再灌注24 h上調(diào)約2.1倍，再灌注48 h上調(diào)約2.5倍，再灌注72 h上調(diào)約3.14倍，與對(duì)照組比較有明顯差異(24 h,P=0.005;48 h,P=0.004；72 h,P=0.004)。

圖1 OGD誘導(dǎo)3h再灌注0,12,24,48,72 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)BDNF蛋白表達(dá)水平變化 隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)BDNF表達(dá)水平逐漸下降(與對(duì)照組再灌注注不同時(shí)間點(diǎn)比較,*P<0.05,**P<0.01)

圖2 OGD誘導(dǎo)3 h再灌注0,12,24,48,72 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)Furin蛋白的表達(dá)水平變化 隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)Furin表達(dá)逐漸上調(diào)(再灌注12h與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異,P>0.05;再灌注24,48,72 h與對(duì)照組比較有明顯差異,P<0.01)

3 討 論

Furin是原蛋白轉(zhuǎn)化酶家族成員之一，其切割底物廣泛。研究表明Furin是BDNF細(xì)胞內(nèi)分泌通路上的關(guān)鍵性切割酶。BDNF前體蛋白經(jīng)Fuirn的切割后形成具有生物活性成熟的BDNF。并且研究表明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白前體與成熟的神經(jīng)因子具有絕然相反的生物學(xué)效應(yīng),即蛋白前體誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡，而成熟的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)元生存，參與突觸可塑性調(diào)節(jié)。由此可見Furin在決定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子生物效應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。來(lái)源于癌細(xì)胞的研究結(jié)果表明Furin在低氧條件下表達(dá)水平上調(diào)。

BDNF最初以pro-BDNF的形態(tài)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成，pro-BDNF在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)Furin切割后形成成熟的mBDNF，在病理狀態(tài)下BDNF的表達(dá)水平發(fā)生變化，即在癲癇模型中發(fā)現(xiàn)BDNF表達(dá)水平上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)原蛋白轉(zhuǎn)化酶PC1介導(dǎo)了BDNF的表達(dá)水平上調(diào)過(guò)程[4]；在神經(jīng)退行性疾病中如AD患者中皮質(zhì)和海馬分泌的BDNF表達(dá)水平下調(diào)，BDNFmRNA表達(dá)水平下調(diào)[5]；在精神心理性疾病如抑郁海馬分泌的BDNF的表達(dá)水平也是下調(diào)[6]。在各種病理狀態(tài)下BDNF表達(dá)水平變化的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制不同，并且大多數(shù)情況下其具體的細(xì)胞內(nèi)分泌通路調(diào)控并不十分清楚。另外，在不同的細(xì)胞類型中BDNF的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)通路可能也不一樣。

對(duì)缺血缺氧這一病理狀態(tài)下我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Furin介導(dǎo)了OGD誘導(dǎo)激活的星形細(xì)胞的BDNF表達(dá)水平的上調(diào)過(guò)程，這一過(guò)程可能參與急性腦缺血時(shí)星形細(xì)胞的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制[3]。為進(jìn)一步明確在缺血缺氧的神經(jīng)元內(nèi)是否同樣Furin也參與的BDNF的表達(dá)水平變化過(guò)程。本研究利用OGD誘導(dǎo)模型模擬急性腦缺血時(shí)海馬神經(jīng)元觀察其細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)水平變化。在OGD誘導(dǎo)再灌注后海馬神經(jīng)元BDNF的表達(dá)水平隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸下調(diào)而Furin的表達(dá)呈逐漸上調(diào)。從初步研究結(jié)果分析Furin沒有參與OGD時(shí)海馬神經(jīng)元內(nèi)BDNF的表達(dá)水平變化過(guò)程。其原因可能在于原蛋白酶家族其他成員參與了這一條調(diào)控過(guò)程。原蛋白轉(zhuǎn)化酶家族成員共有7個(gè)，分別為Furin,PACE4,PC5/6,PC1/PC3,PC4,PACE4,LPC/PC7，其切割底物存在交叉。另外，研究發(fā)現(xiàn)在坐骨神經(jīng)損傷時(shí)PC1,PC5,Furin和PC7均參與雪旺氏細(xì)胞的BDNF表達(dá)水平上調(diào)過(guò)程[7]。在后續(xù)的研究中我們將進(jìn)一步研究海馬神經(jīng)元內(nèi)的BDNF的細(xì)胞內(nèi)分泌過(guò)程的酶切調(diào)節(jié)機(jī)制。