王堯淇 常盼 吳娟 陳溪萍 陶陸陽(yáng)

除凋亡(apoptosis)和壞死(Necrosis)兩種經(jīng)典細(xì)胞死亡模式以外，很多學(xué)者研究表明在腦外傷或腦卒中的病理生理發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中仍有其它的細(xì)胞死亡形式參與其中，如脹亡(oncosis)、自噬性死亡(autoschizis)、非凋亡性程序性細(xì)胞死亡(paraptosis)等[1]。腦外傷(traumatic brain injury，TBI)除外力直接作用導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)挫傷、出血、水腫等直接原發(fā)損傷外，還有涉及多種分子生物效應(yīng)如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的死亡、代謝、修復(fù)過(guò)程等。近年來(lái)，關(guān)于細(xì)胞死亡過(guò)程信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控也成為中樞性神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病研究的熱點(diǎn)之一，對(duì)于探討減少神經(jīng)細(xì)胞死亡和改善神經(jīng)功能障礙的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，與程序性壞死密切相關(guān)的受體相關(guān)蛋白R(shí)IP-1能夠被Necrostatin-1(Nec-1)充分抑制，分子量為259.3，分子式為5-(Indol-3-ylmethyl)-(2-thio-3-methyl)hydantoin。You等使用Nec-1證明程序性壞死也是TBI誘發(fā)的細(xì)胞死亡的重要方式之一，除了先前發(fā)現(xiàn)的凋亡和自噬性細(xì)胞死亡外，在腦外傷后引起的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程還包括程序性壞死(programmed necroptotic cell death,Necroptosis)[2]。我們已進(jìn)行的研究表明，Nec-1除了能夠抑制腦外傷引起程序性壞死外，還可以進(jìn)一步抑制自噬，從而揭示TBI誘導(dǎo)的不同細(xì)胞死亡方式可以存在一種“串話”機(jī)制，共同影響腦外傷的預(yù)后[3]。本研究利用形態(tài)學(xué)與行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，探討程序性壞死特異性抑制劑在腦外傷引起的小鼠組織缺損和行為能力(運(yùn)動(dòng)功能和學(xué)習(xí)能力)障礙中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康昆明小鼠，體重在25 g左右，共72只，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組，腦外傷+二甲基亞砜(DMSO)組，腦外傷+Nec-1(Nec-1)組，每組各24只。

1.2 藥物與試劑

Necrostatin-1(Nec-1,Sigma-Aldrich 公司)；二甲基亞砜[DMSO，生工生物工程(上海)股份有限公司]；4%水合氯醛[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 儀器

電子精密天平(AL104)，Mettler-Toledo公司；立體定位儀，美國(guó)Kopp’s公司；自動(dòng)顱骨鉆，韓國(guó)Precision 公司；冰凍切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司；光電子VI-470 CCD相機(jī)，美國(guó)Ludl Electronic Product公司；水迷宮，上海移數(shù)信息科技有限公司；自由落體打擊器，自制；爬桿工具，自制。

1.4 方法

1.4.1 小鼠定量腦外傷模型建立及分組

稱取小鼠重量，篩選使用25 g左右的成年健康小鼠，經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉，利用立體定位儀，將小鼠頭部固定好，充分剪毛，盡量暴露頭皮，用70%已用酒精消毒，手術(shù)刀取頭皮正中切口，長(zhǎng)2.0 cm，右側(cè)頭顱骨膜采取頓性方法剝離，在頭部冠狀縫后、中線旁各1.0 mm位置用圓形鉆頭骨鉆鋸開(kāi)一直徑5.0 mm骨窗，顯露硬腦膜，確保硬腦膜完整；擁有壓力傳感記錄儀、支座、引導(dǎo)桿、自由落體和液傳導(dǎo)撞筒等部分組裝成為改良的自由落體打擊腦外傷制模裝置；使用2個(gè)活塞封閉撞筒兩端，中空潤(rùn)滑油潤(rùn)滑，壓力傳感器通過(guò)側(cè)管連接；壓深調(diào)控桿和等張彈簧位于頂部活塞和撞筒之間，半徑2 mm的沖擊桿設(shè)置在底部活塞內(nèi)側(cè)；當(dāng)引導(dǎo)桿引導(dǎo)落體下降，撞擊上活塞，壓深調(diào)控桿可以讓上下活塞在設(shè)置范圍里移動(dòng)，硬膜及腦組織被沖擊桿撞擊，撞擊時(shí)間和撞筒內(nèi)壓，在撞擊時(shí)記錄；自由落體打擊器由支座、引導(dǎo)桿、砝碼、等張彈簧、液體傳導(dǎo)撞筒、壓力傳感記錄儀和沖擊桿等部分組成；撞筒上下端被2個(gè)活塞封閉，中間裝有潤(rùn)滑油，通過(guò)側(cè)管接壓力傳感器；按照文獻(xiàn)[4]報(bào)道的方法，落體使用40 g砝碼，下落高度為20 cm，控制以金屬圓柱下降<2 mm，進(jìn)行小鼠腦外傷造模，逐層消毒以預(yù)防創(chuàng)口感染，縫合頭皮。

DMSO 1 μL溶解配制成為Necrostatin-1(Nec-1，2.6 μg/μL)使用液，右側(cè)側(cè)腦室打擊前15 min注射，分組成為Nec-1組；溶劑DMSO 1 μL，打擊前15 min右側(cè)側(cè)腦室注射的小鼠，為DMSO組；假手術(shù)組(Sham組)僅切開(kāi)頭皮、右頂部開(kāi)骨窗，不致腦外傷。

1.4.2 爬桿試驗(yàn)和水迷宮定位航行試驗(yàn)

每組小鼠各15只，腦外傷后24 h開(kāi)始進(jìn)行爬桿試驗(yàn)，進(jìn)行7 d，然后進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)；進(jìn)行爬桿試驗(yàn)時(shí)用手將小鼠的尾巴輕輕拎起，讓小鼠2個(gè)前爪抓住立柱間鐵絲線的中部，從前、左、右3個(gè)方向使每只小鼠重復(fù)操作3次，評(píng)分方法根據(jù)表1，取平均分。

表1 爬桿試驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

Morris水迷宮檢測(cè)系統(tǒng)包括一部圖像全自動(dòng)采編處理系統(tǒng)(包括攝像機(jī)、錄像機(jī)、顯示器和分析軟件等)，1個(gè)大的盛有染料水的圓形水桶和供小鼠站立的平臺(tái)隱藏在水面下；水桶的高度為0.5 m，半徑0.6 m，平臺(tái)高度為0.3 m、直徑為15 cm，碳粉作為染料加入水內(nèi)混合充分，調(diào)整水溫25 ℃左右，平臺(tái)位于水下，小鼠無(wú)法在行為學(xué)訓(xùn)練過(guò)程中看到；將4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)在水桶內(nèi)壁等距離設(shè)置，圓形水面便形成四個(gè)象限，第3象限的中央放置平臺(tái)，位于水面下1.5 cm；小鼠頭朝向桶壁分別在各象限放入水中，讓小鼠隨機(jī)游泳，在120 s內(nèi)未搜尋到平臺(tái)，并站在臺(tái)上小鼠，可將小鼠牽拉到平臺(tái)上站立，訓(xùn)練后小鼠要求能夠在平臺(tái)停留20 s以上，而后在進(jìn)行下一次訓(xùn)練；考察小鼠學(xué)習(xí)能力，必須進(jìn)行數(shù)天時(shí)間的定位航行試驗(yàn)(place navigation)，小鼠搜尋平臺(tái)的潛伏期進(jìn)行記錄，用于評(píng)價(jià)。

外傷后第8 d小鼠開(kāi)始第1次水迷宮實(shí)驗(yàn)，每日進(jìn)行1次，小鼠每次隨機(jī)選擇象限進(jìn)入水中，并連續(xù)完成4個(gè)象限，連續(xù)7 d小鼠接受訓(xùn)練，尋找水下平臺(tái)，并將小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)記錄，后續(xù)2 d，將平臺(tái)顯露在水面以上，讓平臺(tái)在小鼠可視情形下進(jìn)行測(cè)試。

1.4.3 腦組織缺損體積測(cè)量

選取Sham組、DMSO組和NEC-1組小鼠各9只；腦外傷后21 d，麻醉斷頭，解剖取出全腦，利用液氮將腦組織迅速冰凍15 s，然后再利用冰凍切片機(jī)進(jìn)行切片，各組選擇一致斷面(切片厚度選擇12 μm，每個(gè)斷面250 μm，分為8個(gè)斷面)，蘇木精染色；等倍放大切片，使用VI-470 CCD光電子相機(jī)進(jìn)行圖像采集，采集圖像后提取腦組織缺損區(qū)，將電子圖像導(dǎo)入電腦后利用Image-Pro Solution圖像處理軟件，測(cè)量未手術(shù)側(cè)皮質(zhì)總的面積，Cavalieri方法確定損傷皮質(zhì)體積占整個(gè)皮質(zhì)體積的比例，計(jì)算公式腦組織損傷體積(%)=(健側(cè)體積-損傷側(cè)體積)/健側(cè)體積×100%。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和t檢驗(yàn)。以P<0.05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 爬桿試驗(yàn)

腦外傷后1 d DMSO組小鼠爬桿試驗(yàn)評(píng)分較Sham組明顯降低(P<0.01)，傷后2～7 d評(píng)分回升，Nec-1側(cè)腦室預(yù)給藥可加快小鼠腦外傷后運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)過(guò)程(P<0.05)(圖1)。

圖1 腦外傷后1～7 d各組爬桿試驗(yàn)得分 與DMSO組比較,#P<0.01,*P<0.05

2.2 水迷宮試驗(yàn)

小鼠腦外傷后第9～14 d DMSO組與Sham組比較，尋找平臺(tái)潛伏期更長(zhǎng)(P<0.05)；與DMSO組比較，Nec-1組在腦外傷后第9～12 d搜尋平臺(tái)表現(xiàn)為更短的潛伏期(P<0.05) (圖2)。

圖2 腦外傷后8～16 d各組水迷宮定位航行潛伏期 與DMSO組比較,#P<0.05,*P<0.05

2.3 腦組織缺損體積測(cè)量

腦外傷后21 d DMSO組小鼠與sham組小鼠比較明顯可以見(jiàn)到部分腦組織缺損(P<0.01)，然而與DMSO組比較，Nec-1預(yù)處理能顯著減小腦外傷后腦組織缺損體積(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組小鼠腦外傷后21 d腦組織缺損體積 與DMSO組比較,#P<0.01,*P<0.05

3 討 論

大量報(bào)道表明，腦外傷(TBI)除了可以造成腦組織直接破壞、神經(jīng)細(xì)胞非程序性壞死外，還可以通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，觸發(fā)細(xì)胞死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控自噬或者程序性壞死等途徑，誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡，進(jìn)一步影響腦外傷后神經(jīng)功能轉(zhuǎn)歸。研究證實(shí)，參與腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞損傷的病理機(jī)制主要涉及線粒體損傷及功能障礙、氧自由基產(chǎn)生、半胱天冬氨酸酶(caspases)系統(tǒng)激活、繼發(fā)性興奮性氨基酸受體激活、炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂等[5]。我們之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多種程序性細(xì)胞死亡方式參與了腦外傷后的信號(hào)調(diào)控且可以進(jìn)一步影響腦外傷后的腦組織修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)[6-7]。因此，研究腦外傷造成的神經(jīng)細(xì)胞死亡必須考慮多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，而細(xì)胞死亡方式調(diào)控的研究也已經(jīng)成為腦外傷的研究熱點(diǎn)之一，如果可以發(fā)現(xiàn)針對(duì)腦外傷后引起的多種生物信號(hào)的綜合干預(yù)手段，則有望形成更加完善的腦外傷綜合治療方案，對(duì)研究改善腦外傷后神經(jīng)功能障礙具有重要意義。

近年來(lái)，學(xué)者發(fā)現(xiàn)壞死一定條件下也是可以受細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)的死亡方式，并非絕對(duì)消極的細(xì)胞死亡過(guò)程[8]。當(dāng)caspase-8活性減弱就無(wú)法完全分解受體交互作用蛋白-1(RIP1)和受體交互作用蛋白-3(RIP3)，后者聚集而成的復(fù)合體能夠互相磷酸化彼此的死亡結(jié)構(gòu)域，形成激活型RIP3，將細(xì)胞壞死信號(hào)向下游傳遞[9-10]。程序性壞死是受體介導(dǎo)非caspase依賴型程序性細(xì)胞死亡方式，多年研究發(fā)現(xiàn)，程序性壞死有以下特征：(1)組織學(xué)檢驗(yàn)具有壞死形態(tài)特征，前期能夠見(jiàn)到細(xì)胞膜破壞；(2)同時(shí)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠產(chǎn)生自噬；(3)線粒體膜電位消失；(4)特定情況下可出現(xiàn)細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加；(5)能夠被特異性抑制NEC-1拮抗，而凋亡抑制劑不能夠影響壞死過(guò)程[11-12]。

Necrostatin-1(NEC-1)被研究中證實(shí)是一種細(xì)胞受體交互作用蛋白激酶-1(RIP-1)的特異性抑制劑，能有效抑制程序性壞死[12-13]。我們之前的研究也在小鼠腦外傷模型上證實(shí)了腦外傷可以導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，而且程序性壞死抑制劑Nec-1可以減少腦外傷后的神經(jīng)元死亡數(shù)目，說(shuō)明程序性壞死參與了腦外傷后的神經(jīng)元程序性死亡過(guò)程。我們研究還進(jìn)一步表明，通過(guò)抑制程序性壞死可以同時(shí)抑制腦外傷后皮質(zhì)組織和海馬組織中的自噬和凋亡，并且通過(guò)聯(lián)合使用自噬和凋亡特異性抑制劑，我們發(fā)現(xiàn)在小鼠腦外傷模型上抑制自噬可以同時(shí)抑制凋亡半胱天冬氨酸酶(caspases)系統(tǒng)的激活，達(dá)到同時(shí)抑制凋亡的效果，而單獨(dú)抑制凋亡，隨著凋亡活性的抑制，可同時(shí)引起微管相關(guān)蛋白1輕鏈3的-II(LC3-II)表達(dá)上調(diào)，自噬活性增加[3]，這進(jìn)一步說(shuō)明不同程序性細(xì)胞死亡方式在小鼠TBI后的細(xì)胞程序性死亡調(diào)控中也具有潛在的“串話”機(jī)制。小鼠腦外傷后神經(jīng)功能的預(yù)后與多種細(xì)胞死亡方式調(diào)控有關(guān)，本研究結(jié)果表明在我們之前已有的研究基礎(chǔ)上又進(jìn)一步證明抑制程序性壞死同樣也可以減少小鼠腦外傷后腦組織損傷體積，從而有利于小鼠腦外傷后腦組織形態(tài)的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)也通過(guò)爬桿試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室Nec-1預(yù)給藥可以起到改善腦外傷后運(yùn)動(dòng)功能和學(xué)習(xí)能力的效果。這也進(jìn)一步提示程序性壞死的調(diào)控有望成為腦外傷新的治療靶點(diǎn)。