王 儉，謝旺凱，李 婷，呂詩(shī)卉，倪 超，薛向陽(yáng)，陳向敏，陳 俊△

(溫州醫(yī)科大學(xué)：1.第一臨床醫(yī)學(xué)院；2.第二臨床醫(yī)學(xué)院；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院/生命科學(xué)院，浙江溫州 325035)

宮頸癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，位于女性惡性腫瘤的第二位[1]。研究已證實(shí)，幾乎所有宮頸癌都是由人乳頭瘤病毒(HPV)尤其是高危型 HPV感染引發(fā)，因此高危型HPV檢測(cè)逐漸成為宮頸癌篩查的研究熱點(diǎn)[2]。目前，HPV研究主要針對(duì)HPV基因組進(jìn)行。HPV基因組可分為早期區(qū)、晚期區(qū)及上游調(diào)節(jié)區(qū)(URR)或長(zhǎng)控制區(qū)(LCR)或非編碼區(qū)(NCR)。早期區(qū)編碼E6、E7、E1(E8)、E2 、E4 (E3)、E5等5～8個(gè)基因，晚期區(qū)編碼L1和L2病毒結(jié)構(gòu)蛋白[3]。目前國(guó)內(nèi)外廣泛采用HPV通用引物定位在HPVL1基因上進(jìn)行檢測(cè)[4]。但是在高危型HPV感染過(guò)程中，其基因會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組中，這是引發(fā)宮頸細(xì)胞癌變發(fā)生的前提[5]。而高危型HPV DNA的整合過(guò)程往往會(huì)發(fā)生基因斷裂缺失,如E1/E2調(diào)控區(qū)和L1/L2衣殼蛋白基因的缺失，因此基于L1基因的檢測(cè)存在一定的漏診現(xiàn)象。然而，研究表明E6和E7基因在整合過(guò)程中卻可以保留完整，不易發(fā)生缺失，因此，E6/E7基因被認(rèn)為是檢測(cè)HPV最為理想的靶點(diǎn)[6]?；谝陨犀F(xiàn)象，本研究針對(duì)HPV E6/E7基因，設(shè)計(jì)我國(guó)感染率較高的7種高危型HPV特異性引物，包括HPV16、18、31、33、51、52、58，建立一種成本低廉、效率更高的檢測(cè)宮頸腫瘤、脫落細(xì)胞等組織高危型HPV感染的多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)方法，并與現(xiàn)在臨床上主流的流式熒光雜交法進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其臨床意義。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

1.1.1宮頸腫瘤組織標(biāo)本 68份宮頸腫瘤組織標(biāo)本采自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科68例手術(shù)患者，并經(jīng)病理檢查確診，其中宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN) 1級(jí)12例，CIN 2級(jí)19例，CIN 3級(jí)19例，宮頸鱗癌12例，宮頸腺癌2例，正常宮頸(內(nèi)膜透明細(xì)胞癌)4例，標(biāo)本離體后保存于液氮中?；颊吣挲g25～69歲，平均(42.4±1.1)歲。所有標(biāo)本收集均征得患者及或家屬的同意，并簽署知情同意書。

1.1.2宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本 150份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本均取自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科門診患者?；颊吣挲g18～78歲，平均(43.1±11.6)歲。所有標(biāo)本收集均征得患者及或家屬的同意，并簽署知情同意書。HPV16陽(yáng)性的Siha細(xì)胞和HPV18陽(yáng)性的Hela細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC，并由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2DNA提取 宮頸腫瘤組織標(biāo)本每份切取50 g病變區(qū)組織，碾碎后加入50 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)中制成懸液備用；Siha、Hela細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至長(zhǎng)滿50 mL培養(yǎng)瓶后，也制成懸液備用。制備的懸液采用DNA提取試劑盒[TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit(DP304)]提取DNA。將DNA模板統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL。宮頸脫落細(xì)胞溶于細(xì)胞保存液中，取2 mL細(xì)胞溶液10 000 r/min離心1 min后去上清液，采用DNA提取試劑盒提取DNA。

1.3引物

1.3.1引物設(shè)計(jì) 在分析同源性的基礎(chǔ)上，針對(duì)我國(guó)流行的主要高危型HPV16、18、31、33、51、52、58及相應(yīng)HPV基因組的E6/E7基因，設(shè)計(jì)這7種HPV型別的引物。由北京六合華大基因科技有限公司合成[7]。引物序列見表1。將合成的引物稀釋成10 μmol/L，-20 ℃保存，待用。

表1 各型別HPV特異性引物序列

1.3.2引物特異性驗(yàn)證 為驗(yàn)證相應(yīng)HPV型別引物特異性，以明確HPV分型的宮頸腫瘤組織標(biāo)本和細(xì)胞株的DNA為模板，引物FP 10 μmol/L，引物RP 10 μmol/L，Taq Mix 12.5 μL[TIANGEN 2×Taq PCR MasterMix(KT201)]配制成25 μL反應(yīng)體系。退火溫度為63 ℃(16、18、31、33、51、58型)，65 ℃(52型)。熱循環(huán)條件設(shè)置如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；退火30 s；72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃后延伸5 min。在Bio-Rad S1000 PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，基因測(cè)序，并與已公布的各型別HPV基因序列比較。

1.3.3引物敏感性驗(yàn)證 為分析特異性引物敏感性， 以10.00、1.00、0.10、0.01 ng不同HPV型別陽(yáng)性的DNA作為模板進(jìn)行試驗(yàn)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并進(jìn)行敏感性分析。

1.4E6/E7多重PCR檢測(cè)方法的構(gòu)建 以7種明確HPV分型的宮頸腫瘤組織標(biāo)本為DNA模板，將HPV16、18、31、33、51、52、58型的特異性引物按濃度1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合加入4 μL，RNase-free去離子水1 μL，Taq Mix 7.5 μL；Q-Solution+1.5 μL[QIAGEN Multiplex PCR kit(Cat.No.206143)]配制成15 μL體系。熱循環(huán)條件設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性30 s；63 ℃退火90 s；72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后68 ℃后延伸15 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)比各型別HPV的單一PCR產(chǎn)物電泳圖譜以確定多重PCR方法的特異性。在此基礎(chǔ)上，以10.00、1.00、0.10、0.01 ng不同HPV型別陽(yáng)性的DNA作為模板進(jìn)行試驗(yàn)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并進(jìn)行敏感性分析。同時(shí)，為避免實(shí)驗(yàn)存在的偶然性，相隔一定量的時(shí)間后，同樣以新建立方法時(shí)所使用的7種高危型別陽(yáng)性標(biāo)本DNA作為模板，在相同條件下以同樣的參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證多重PCR方法的穩(wěn)定性。

1.5宮頸腫瘤組織標(biāo)本HPV感染型別檢測(cè) 對(duì)68份宮頸腫瘤組織標(biāo)本采用所構(gòu)建的多重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)對(duì)相同標(biāo)本采用流式熒光雜交法進(jìn)行平行檢測(cè)，記錄并比較分析結(jié)果。

1.6宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本檢測(cè) 使用新建立的多重PCR方法對(duì)150份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行HPV感染情況檢測(cè)，同時(shí)對(duì)相同的標(biāo)本采用流式熒光雜交法進(jìn)行平行檢測(cè)，記錄并比較分析結(jié)果。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1引物設(shè)計(jì)結(jié)果 引物特異性實(shí)驗(yàn)表明7種高危型HPVE6/E7引物(HPV16、18、31、33、51、52、58)均具有特異性，見圖1。同時(shí)敏感性分析實(shí)驗(yàn)顯示：HPV16、18、33型DNA 模板量低至1 ng仍能擴(kuò)增特異目的片段，HPV31型DNA模板量低至10 ng仍能擴(kuò)增特異目的片段，HPV51型DNA模板量低至0.1 ng仍能擴(kuò)增特異目的片段，HPV52、58型DNA模板量低至0.01 ng仍能擴(kuò)增特異目的片段。

2.2E6/E7多重PCR檢測(cè)方法的建立 對(duì)已經(jīng)明確了HPV分型的宮頸腫瘤標(biāo)本和細(xì)胞株所提取的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示出現(xiàn)單一條帶，與使用單一型別引物進(jìn)行PCR的結(jié)果一致，提示所建立的多重PCR可特異檢測(cè)這7種HPV亞型，見圖2。且敏感性分析實(shí)驗(yàn)顯示：HPV16、18、31、33、58型DNA模板量低至10 ng仍能擴(kuò)增特異目的片段，HPV51和52型DNA模板量低至0.1 ng仍能擴(kuò)增特異目的片段。

2.3宮頸腫瘤組織HPV檢測(cè)結(jié)果 以新建立的多重PCR方法檢測(cè)68份宮頸腫瘤組織標(biāo)本，見圖3，根據(jù)電泳條帶判斷68份宮頸腫瘤組織標(biāo)本HPV感染情況，檢測(cè)出HPV陽(yáng)性標(biāo)本48份(70.59%)，其中HPV16陽(yáng)性36份(52.94%)，HPV18陽(yáng)性3份(4.41%)，HPV31陽(yáng)性4份(5.88%)，HPV33陽(yáng)性7份(10.29%)，HPV51陽(yáng)性2份(2.94%)，HPV58陽(yáng)性3份(4.41%)，多重感染6份(8.82%)。高于流式熒光雜交法檢測(cè)所顯示39.71%的感染率，2種方法檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.43，P<0.05)。

注：M為D2000 DNA標(biāo)記物；1為HPV16陽(yáng)性標(biāo)本；2為HPV18陽(yáng)性標(biāo)本；3為HPV31陽(yáng)性標(biāo)本；4為HPV33陽(yáng)性標(biāo)本；5為 HPV51陽(yáng)性標(biāo)本；6為HPV52陽(yáng)性標(biāo)本；7為 HPV58陽(yáng)性標(biāo)本

圖1所設(shè)計(jì)的7種高危型別HPV E6/E7引物的特異性分析

注：A為HPV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)條帶；B為HPV 7種亞型引物特異性分析；M1為D2000 DNA 標(biāo)記物；M2為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)條帶；1為HPV16陽(yáng)性標(biāo)本；2為HPV18陽(yáng)性標(biāo)本；3為 HPV31陽(yáng)性標(biāo)本；4為HPV33陽(yáng)性標(biāo)本；5為HPV51陽(yáng)性標(biāo)本；6為HPV52陽(yáng)性標(biāo)本；7為HPV58陽(yáng)性標(biāo)本

圖2多重PCR法電泳結(jié)果分析

2.4宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 150份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本用新建立的多重PCR方法及流式熒光雜交法檢測(cè)的結(jié)果顯示7種高危型別(HPV16、18、31、33、51、52、58)檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.68，P>0.05)，見表2。

注：M1為 D2000 DNA標(biāo)記物；M2為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)條帶；1～68為宮頸腫瘤組織標(biāo)本

圖3 68份宮頸腫瘤組織多重PCR檢測(cè)結(jié)果分析

表2 150份宮頸脫落細(xì)胞不同檢測(cè)方法的HPV檢測(cè)結(jié)果(n=150)

3 討 論

高危型HPV持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的重要原因。越來(lái)越多的研究表明HPV基因組檢測(cè)對(duì)宮頸病變預(yù)測(cè)和術(shù)后療效判斷有利，可以避免不必要的診斷和治療。因此，國(guó)內(nèi)外采用了很多種方法對(duì)HPV感染進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用于臨床宮頸癌篩查和防治。

現(xiàn)在臨床上采用較多的是基于L1衣殼蛋白基因的HPV檢測(cè)方法，如流式熒光雜交法[8]。但由于在HPV感染過(guò)程中，病毒 DNA通常會(huì)與宿主染色體整合，會(huì)改變整合位點(diǎn)及鄰近宿主基因的表達(dá)，使部分HPV L1基因組發(fā)生斷裂丟失，最終導(dǎo)致HPV L1衣殼蛋白也表達(dá)缺失，所以基于L1基因序列的HPV檢測(cè)方法容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，這也限制了其在臨床上的使用[9]。而早期蛋白基因E6/E7在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中持續(xù)存在，且其表達(dá)的E6/E7早期蛋白在宮頸癌變過(guò)程中起著重要作用。惡性腫瘤病變時(shí)，HPV DNA整合到宿主DNA當(dāng)中，通常導(dǎo)致E2基因中斷從而使E6/E7基因表達(dá)增強(qiáng)[10]。E6/E7蛋白分別抑制P53、Rb基因的活性，激活人細(xì)胞端粒酶的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞異常分化，導(dǎo)致正常細(xì)胞永生化，最終形成腫瘤[11]。因此，對(duì)HPV E6/E7基因進(jìn)行檢測(cè)，能從根源上對(duì)宮頸病變進(jìn)行診斷和預(yù)防，是判斷HPV感染的更好選擇。然而，臨床上針對(duì)E6/E7的檢測(cè)方法不多，尤其是多重PCR的檢測(cè)方法幾乎沒有。為此本研究主要構(gòu)建了基于E6/E7的多重PCR方法檢測(cè)HPV的感染情況，在對(duì)HPV進(jìn)行同源性分析后證實(shí)各HPV亞型的E6/E7基因具有特異的保守片段，據(jù)此選擇設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了中國(guó)人群感染率較高的7種高危型別HPV E6/E7的特異性引物，優(yōu)化條件后建立了一種基于E6/E7基因的HPV多重PCR分型檢測(cè)方法。對(duì)已明確型別的宮頸癌組織標(biāo)本及宮頸細(xì)胞的檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本出現(xiàn)條帶，而陰性標(biāo)本未出現(xiàn)條帶證明其特異性好，而且實(shí)驗(yàn)還驗(yàn)證了該多重PCR技術(shù)檢測(cè)靈敏度能達(dá)到10.00 ng，技術(shù)穩(wěn)定性良好，滿足臨床標(biāo)本檢測(cè)方法的要求。

68份宮頸腫瘤組織標(biāo)本的HPV檢測(cè)結(jié)果顯示，所構(gòu)建的基于E6/E7多重PCR檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于基于L1基因的流式熒光雜交法檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而對(duì)門診采集的150份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示7種高危型別檢出率與流式熒光雜交法檢出率并無(wú)差異，考慮到門診患者高危型別感染較少，樣本數(shù)不夠大，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

臨床上使用的基于L1基因的流式熒光雜交法檢測(cè)費(fèi)用較高，操作復(fù)雜，需要大型儀器設(shè)備支持，不利于在鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院開展。而本研究所建立的基于E6/E7多重PCR法不僅能夠一次檢測(cè)HPV16、18、31、33、51、52和58 7種高危型別，而且具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉和所需儀器較少且較易獲得等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)研究結(jié)果也已表明兩種方法檢出率高度相近。因此，基于E6/E7多重PCR法在應(yīng)用中能極大彌補(bǔ)流式熒光雜交法在成本和技術(shù)等方面的不足，同時(shí)可以減少多次檢測(cè)帶來(lái)的交叉污染及高成本的問(wèn)題，適合在臨床大面積開展患者高危型HPV感染的早期篩查。