王彥武 覃光球 何 勵 彭 亮 高玉秋 王紹龍

廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理所，廣西南寧 530028

雨生紅球藻（haematococcus pluvialis）是目前已知自然界中蝦青素（Astaxanthin）含量最豐富的生物[1]，可達干重的1.43%～3.51%[2]，被看作是天然蝦青素的“濃縮品”。研究顯示，蝦青素具有抗氧化[3-4]、抗腫瘤[5-6]、抗輻射[7]、抗炎[8-9]、增強免疫力[10]、調(diào)節(jié)血糖[11]等作用，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用較廣[12]。2010年10月，我國原衛(wèi)生部批準雨生紅球藻為新資源食品，隨后市場上涌現(xiàn)出國產(chǎn)雨生紅球藻的不同劑型保健產(chǎn)品。本實驗對以雨生紅球藻為主要成分的某品牌雨生紅球藻軟膠囊進行急性、遺傳毒性和大鼠30 d喂養(yǎng)試驗研究，旨在為雨生紅球藻及其產(chǎn)品開發(fā)提供安全性毒理學評價試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

北京某醫(yī)藥科技有限公司送檢的雨生紅球藻軟膠囊，內(nèi)容物為紫紅色油狀物，主要成分為雨生紅球藻油。人口服推薦用量為每人（成人）每日1次，每次1粒，成人體重按60 kg計算，折合劑量為6.7 mg/（kg·BW）。

1.2 實驗動物

廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供的SPF級健康昆明種小鼠120只及SPF級健康SD種大鼠80只，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2013-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號為44007200014053（小鼠）、44007200015 232（大鼠）。動物在實驗室屏障系統(tǒng)正常飼養(yǎng)3 d后使用，環(huán)境溫度為22～25℃，相對濕度為55%～70%。動物試驗倫理經(jīng)廣西疾病預(yù)防控制中心倫理審查委員會批準。

1.3 儀器

全自動生化儀（日本Olympus AU400），全自動血球計數(shù)儀（日本Sysmex XT2000i），全自動半薄切片機（德國Leica RM2265），全自動染色機（德國Leica ST5020），顯微鏡（德國Leica DM3000）。

1.4 方法

急性經(jīng)口毒性試驗、遺傳毒性試驗及大鼠30 d喂養(yǎng)試驗均參照 《食品安全性毒理學評價程序和方法》GB15193-2003的相關(guān)試驗方法[13]進行。采用最大耐受劑量法（MTD）進行小鼠急性經(jīng)口毒性試驗，SPF級健康昆明種小鼠20只，雌雄各半。按該軟膠囊內(nèi)容物 0.9 g/ml比重計算，劑量為 18 000 mg/（kg·BW），觀察動物的中毒表現(xiàn)和死亡情況；小鼠精子畸形試驗和小鼠骨髓細胞微核試驗均設(shè)10 000、5000、2500 mg/（kg·BW）3個劑量組和環(huán)磷酰胺陽性對照組及陰性對照組，每組動物10只。觀察小鼠精子畸形率及小鼠骨髓微核率，如出現(xiàn)明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計學意義，即確認為陽性結(jié)果；大鼠30 d喂養(yǎng)試驗設(shè)670.0、335.0、167.5 mg/（kg·BW）3 個劑量組 （分別相當于人體推薦劑量的100、50、25倍）和1個玉米油對照組，每組動物20只，雌雄各半。分籠飼養(yǎng)，記錄進食量，灌胃量為 0.5 ml/（100 g·BW），連續(xù)灌胃 30 d 后試驗結(jié)束。處死大鼠，觀察血常規(guī)、血清生化學指標和病理檢查。病理組織學檢查時先對高劑量組和對照組動物的主要臟器進行，如果發(fā)現(xiàn)病變后需對較低劑量組相應(yīng)的器官及組織制片檢查。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，小鼠精子畸形試驗數(shù)據(jù)采用秩和檢驗分析，骨髓細胞微核試驗數(shù)據(jù)采用泊松分布均數(shù)比較法分析，大鼠30 d喂養(yǎng)試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和組間比較。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗

給予受試物后連續(xù)觀察14 d，未見動物死亡，提示該雨生紅球藻軟膠囊 MTD＞18 000 mg/（kg·BW），急性經(jīng)口毒性分級屬無毒級。

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1 小鼠精子畸形試驗 受試物各劑量組與陰性對照組的小鼠精子畸形率在1.51%～1.72%之間，環(huán)磷酰胺陽性對照組為5.28%，各劑量組動物精子畸形率與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而陰性對照組與環(huán)磷酰胺陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示未見該受試物對雄性小鼠的精子產(chǎn)生致突變作用。

2.2.2 骨髓細胞微核試驗 受試物各劑量組與陰性對照組的微核發(fā)生率在0.8‰～1.4‰之間，環(huán)磷酰胺陽性對照組的微核發(fā)生率為24.4‰。各劑量組骨髓細胞微核率與陰性對照組相比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而陰性對照組與環(huán)磷酰胺陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示未見該受試物對小鼠的骨髓細胞有損傷和抑制作用。

2.3 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗

試驗期間各組動物未見明顯中毒表現(xiàn)，大鼠生長發(fā)育良好，試驗結(jié)束時，無動物死亡。各劑量組大鼠終末體重、總增重、總進食量、食物利用率、白細胞總數(shù)、血小板、紅細胞總數(shù)、血紅蛋白以及各項血清生化指標與對照組比較接近，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1～4）。各劑量組大鼠臟器重和臟體比值在正常值范圍內(nèi)，且與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表5）。

表1 受試物對大鼠體重、總增重、進食量、食物利用率的檢查結(jié)果比較（±s）

表1 受試物對大鼠體重、總增重、進食量、食物利用率的檢查結(jié)果比較（±s）

組別 初重（g） 終末重（g） 總增重（g） 總進食量（g）總食物利用率（%）雄性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組雌性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組75.7±4.4 75.8±5.3 75.7±6.3 75.9±4.8 331.8±19.6 333.2±14.5 335.1±14.6 337.7±17.1 256.1±17.3 257.4±13.9 259.4±10.4 261.8±15.4 705.5±52.5 713.6±47.8 714.7±72.2 715.9±63.9 36.4±2.4 36.1±1.8 36.6±3.1 36.7±2.0 74.2±5.7 74.1±7.1 74.1±6.8 74.3±4.7 232.2±18.5 235.4±16.7 231.4±13.3 233.3±14.8 158.0±14.3 161.3±11.0 157.3±10.2 159.0±13.6 594.2±37.6 601.2±45.5 593.2±43.6 596.1±58.7 26.6±1.1 26.9±1.0 26.6±1.8 26.8±2.3

表2 受試物對大鼠血常規(guī)指標的檢查結(jié)果比較（±s）

表2 受試物對大鼠血常規(guī)指標的檢查結(jié)果比較（±s）

性別 白細胞總數(shù)（×109/L）血小板（×109/L）紅細胞總數(shù)（×1012/L）血紅蛋白（g/L）雄性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組雌性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組8.18±0.84 8.27±1.18 8.16±0.53 7.93±1.11 858.7±87.2 854.7±174.7 832.2±153.9 851.8±173.0 7.27±0.48 7.59±0.87 7.36±0.81 7.54±0.66 144.2±9.3 148.6±18.4 144.2±17.2 146.9±12.3 8.17±1.19 8.59±1.30 8.27±0.91 8.63±0.90 874.3±122.1 834.6±125.2 878.2±118.5 850.3±139.9 7.34±0.61 7.54±0.70 7.20±0.53 7.55±0.70 142.6±11.6 147.9±15.2 140.9±10.6 146.0±14.4

2.4 病理學檢查

所有動物進行大體檢查，均未發(fā)現(xiàn)明顯病變。對受試物的670.0 mg/（kg·BW）劑量組和陰性對照組動物的主要臟器進行組織病理學檢查，結(jié)果見圖1。大鼠的肝小葉組織可見肝細胞輕度脂肪變性（劑量組有3只、玉米油對照組有4只），可見肝細胞點狀壞死（劑量組有1只、玉米油對照組有1只），大鼠的肝臟匯管區(qū)可見少量炎細胞浸潤（劑量組有1只、玉米油對照組有2只）；大鼠的腎臟皮質(zhì)部間質(zhì)可見少量炎細胞浸潤（劑量組有2只、玉米油對照組有2只）。以上兩組動物組織病變輕且病程相似，故可以排除與受試物相關(guān)。動物的其他臟器脾、胃、十二指腸、睪丸及卵巢等組織未見病理組織學改變，提示該受試物對大鼠的上述臟器組織無損害作用。

表3 受試物對大鼠血液生化指標的檢查結(jié)果比較（±s）

表3 受試物對大鼠血液生化指標的檢查結(jié)果比較（±s）

性別 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（U/L）丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（U/L）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）雄性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組雌性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組130.0±13.4 128.7±13.1 134.7±9.0 133.9±10.3 44.0±5.1 47.8±3.4 42.5±6.6 47.2±9.1 6.21±0.52 6.14±0.61 6.12±0.74 5.98±0.89 43.5±5.0 43.9±3.9 44.2±4.3 41.1±5.1 133.4±14.5 136.9±14.4 137.2±14.0 131.6±15.4 45.3±6.4 46.1±8.3 44.9±4.3 44.7±5.8 5.96±0.64 6.13±0.50 6.10±0.61 6.05±0.30 45.6±5.2 41.7±7.0 43.3±5.3 45.1±6.5

表4 受試物對大鼠血液生化指標的檢查結(jié)果比較（±s）

表4 受試物對大鼠血液生化指標的檢查結(jié)果比較（±s）

性別 膽固醇（mmol/L）三酰甘油（mmol/L）總蛋白（g/L）白蛋白（g/L）血糖（mmol/L）雄性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組雌性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組2.19±0.28 2.35±0.40 2.16±0.45 2.23±0.36 0.96±0.27 0.97±0.29 1.06±0.16 1.04±0.34 67.2±4.7 67.5±8.6 68.2±6.2 67.1±7.0 32.0±3.5 31.7±5.8 32.8±4.6 33.1±3.8 5.82±0.67 5.91±0.44 5.77±0.50 5.71±0.51 2.28±0.35 2.22±0.30 2.14±0.47 2.34±0.30 0.99±0.46 0.98±0.40 1.13±0.34 1.10±0.20 67.9±4.2 66.6±7.6 66.1±7.3 66.9±5.8 32.6±4.3 33.4±3.1 32.0±2.1 32.6±3.0 5.56±0.40 5.96±0.70 5.81±0.85 5.75±0.30

表5 受試物對大鼠臟器重量和臟器/體重比的檢查結(jié)果（±s）

表5 受試物對大鼠臟器重量和臟器/體重比的檢查結(jié)果（±s）

性別 肝臟濕重（g） 肝體比（%）雄性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組雌性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組9.93±1.26 9.79±0.95 9.88±0.89 9.99±1.08 3.10±0.44 3.03±0.28 3.04±0.29 3.05±0.37 6.86±0.38 7.13±0.46 7.02±0.52 6.98±0.72 3.07±0.33 3.14±0.33 3.14±0.27 3.09±0.28腎臟濕重（g） 腎體比（%）2.53±0.40 2.55±0.22 2.63±0.30 2.59±0.20 0.78±0.11 0.79±0.07 0.81±0.09 0.79±0.07 1.78±0.24 1.82±0.33 1.78±0.24 1.77±0.18 0.80±0.10 0.80±0.14 0.80±0.12 0.79±0.08脾臟濕重（g） 脾體比（%）0.75±0.07 0.72±0.08 0.74±0.09 0.73±0.08 0.23±0.03 0.22±0.02 0.23±0.03 0.22±0.03 0.51±0.04 0.50±0.05 0.53±0.06 0.51±0.05 0.23±0.03 0.22±0.03 0.24±0.03 0.23±0.02睪丸濕重（g） 睪體比（%）3.13±0.31 3.06±0.35 3.15±0.39 3.06±0.37 0.97±0.07 0.95±0.09 0.97±0.12 0.94±0.13

圖1 大鼠的肝臟和腎臟組織病理學改變（HE染色）

3 討論

國內(nèi)外對紅球藻毒性研究報道中的劑型各有不同[14-18]。蝦青素是一種天然的類胡蘿卜素，分子式為C40H52O4與β-胡蘿卜素相似[19-20]。類胡蘿卜素不溶于水，溶于脂肪和脂肪溶劑，因此雨生紅球藻做成軟膠囊劑型的保健品，對人體吸收利用較為合理。

本試驗中，雨生紅球藻軟膠囊最大給藥劑量達18 000 mg/（kg·BW）下，未見動物有中毒癥狀和死亡，急性經(jīng)口毒性為無毒級，反映體內(nèi)生殖細胞和體細胞遺傳毒性試驗的小鼠精子畸形試驗和小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果均為陰性。30 d喂養(yǎng)試驗中，大鼠生長發(fā)育良好，總增重、進食量、食物利用率、血常規(guī)和血液生化等指標等均未受明顯影響。組織病理學檢查大體解剖正常，鏡下觀察到的病變屬動物的自發(fā)輕型病變，提示該雨生紅球藻軟膠囊未見產(chǎn)生毒副作用。

雨生紅球藻為新資源食品，遺傳毒性試驗還應(yīng)兼顧原核和真核細胞、體內(nèi)和體外試驗相結(jié)合的原則增加Ames試驗、V79/HGPRT基因突變試驗、程序外DNA修復(fù)合成（UDS）試驗，為進一步觀察其長期毒性作用，可進行90 d喂養(yǎng)試驗、繁殖試驗、代謝試驗等研究。