于俊民 張小波 李大鶴 趙園園 陳洪葉

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院老年病一病房，黑龍江哈爾濱 150001

心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后心肌細(xì)胞凋亡等一系列變化引起心肌纖維化、心力衰竭，使患者死亡率明顯升高。心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）及多種細(xì)胞因子參與其發(fā)生過程。血管緊張素受體拮抗劑（ARBs）通過阻斷AngⅡ1型受體使血管舒張，降低醛固酮合成及分泌。文獻(xiàn)報(bào)道肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）和胰島素生長(zhǎng)因子 1（insulinlike growth factor 1，IGF-1）的控制與釋放顯著增加血管生成，減少細(xì)胞凋亡，改善心室重塑及心臟功能[1]。HGF是由間質(zhì)細(xì)胞衍生的多功能細(xì)胞因子，有學(xué)者證實(shí)HGF調(diào)節(jié)其他促纖維化細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與肝、腎、心、肺等多種器官的結(jié)構(gòu)重建，起到器官保護(hù)作用，是少數(shù)能阻止纖維化的生長(zhǎng)因子之一[2]。在心肌梗死患者應(yīng)用厄貝沙坦治療過程中筆者觀察到外周血中HGF細(xì)胞因子的水平存在變化[3]，但其如何發(fā)揮作用，是否受其他細(xì)胞因子影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過觀察厄貝沙坦對(duì)心肌梗死大鼠血清HGF水平的影響，探討其改善心肌梗死后心肌纖維化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常2～3月齡雄性Wistar大鼠26只 （長(zhǎng)春億思實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供），體重（250±30）g。

1.2 儀器與材料

厄貝沙坦（安博維，德國(guó)賽諾菲制藥公司）；HGF ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司）；小動(dòng)物呼吸機(jī)（哈佛大學(xué)制造，55-705B型）；離心機(jī)（飛鴿牌DL-50000B）；電子天平（上海精科公司，MP200A）；病理切片機(jī)（德國(guó)菜卡，2135 型）；圖像采集系統(tǒng)（moticam3000）；酶標(biāo)儀（Tecan Infinite Pro，200 型）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 心肌梗死模型制備 大鼠稱重后以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，氣管插管后用小動(dòng)物呼吸機(jī)有氧正壓通氣。于左側(cè)胸腔第四肋間逐層開胸，開放心包后擠壓右側(cè)胸腔使心臟暴露于胸腔外，用絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后，將心臟放回正常位置，并逐層縫合胸腔?；謴?fù)自主呼吸后拔管，保溫待其清醒[4]。另設(shè)假手術(shù)組，采用相同方法冠狀動(dòng)脈處穿線不結(jié)扎。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 選擇建模成功24 h后存活大鼠隨機(jī)分為厄貝沙坦組（n=11）及對(duì)照組（n=9），另設(shè)假手術(shù)組（n=6）。 厄貝沙坦組予以厄貝沙坦[50 mg/（kg·d）]，對(duì)照組及假手術(shù)組予以等體積生理鹽水灌胃，1次/d，4周后處死。

1.3.3 血清HGF濃度測(cè)定 術(shù)后24 h、1、2、4周經(jīng)眶后靜脈叢取血5 ml，采用ELISA法測(cè)定血清HGF水平。

1.3.4 組織形態(tài)學(xué)觀察 于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死大鼠，取結(jié)扎線下部分心肌組織，4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋，制備6 μm的組織切片，HE染色后，于光鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用多因素重復(fù)測(cè)量資料方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織HE染色

缺血心肌HE染色可見假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組與厄貝沙坦組心肌細(xì)胞溶解斷裂，心肌結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核溶解消失，成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，厄貝沙坦組病理改變較對(duì)照組減輕（圖1）。

圖1 大鼠缺血心肌HE染色結(jié)果（400×）

2.2 大鼠血HGF檢測(cè)結(jié)果分析

術(shù)后24 h各組血清中均檢測(cè)到HGF水平，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；假手術(shù)組1周時(shí)的HGF水平低于術(shù)后24 h（P＜0.01），術(shù)后2、4周時(shí)的HGF水平升高但仍低于術(shù)后 24 h（P＜0.01）；術(shù)后 1、2 周時(shí)對(duì)照組及厄貝沙坦組的HGF水平均高于假手術(shù)組（P＜0.01），而術(shù)后2、4周時(shí)厄貝沙坦組的HGF水平較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01）；對(duì)照組術(shù)后1、2周時(shí)的HGF 水平較術(shù)后 24 h 增高（P＜0.01），術(shù)后 2、4 周時(shí)的 HGF 水平高于術(shù)后 1 周時(shí)（P＜0.05，P＜0.01），而厄貝沙坦組術(shù)后4周時(shí)的HGF水平較術(shù)后24 h、1周時(shí)降低（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。

表1 各組大鼠不同時(shí)間段血HGF水平的比較（pg/ml，±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間段血HGF水平的比較（pg/ml，±s）

與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.01；與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.01；與同組 24 h 比較，ΔP＜0.01，★P＜0.05；與同組 1 周比較，▲P＜0.05，※P＜0.01

組別 術(shù)后24 h 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后4周假手術(shù)組（n=6）對(duì)照組（n=9）厄貝沙坦組（n=11）492.66±54.81 484.38±16.21 464.41±26.48 409.74±97.29Δ 544.75±22.14*Δ 495.59±40.91*421.78±103.58Δ 513.60±18.79*Δ▲453.50±36.35#442.81±25.09Δ 507.63±22.90*※418.34±36.50#★※

3 討論

AMI是臨床常見急癥，患者發(fā)生嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙及心室重塑，導(dǎo)致主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE） 發(fā)生率顯著增加，預(yù)后不良[5]。心肌纖維化是心臟成纖維細(xì)胞活性增加，過度產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的過程[6]。AMI后心肌纖維化發(fā)生心力衰竭及猝死[7]。心肌纖維化過程的干預(yù)對(duì)梗死后心肌損傷修復(fù)、心功能改善有重要臨床意義。心肌纖維化是一個(gè)復(fù)雜的病理過程且調(diào)節(jié)因素眾多[8]，伴隨著多種細(xì)胞因子生成及相關(guān)信號(hào)通路的活化。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子及其酪氨酸激酶受體對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、維持心臟功能有重要作用[9]；Sonnenberg等[10]對(duì)心肌梗死大鼠植入HGF基因片段發(fā)現(xiàn)HGF能促進(jìn)血管新生、抑制心肌纖維化；Zhang等[11]對(duì)豬AMI模型注入HGF-MSCs發(fā)現(xiàn)缺血心肌血管密度增高；Met蛋白與HGF結(jié)合后可導(dǎo)致下游多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[12]；HGF與其受體c-Met結(jié)合并激活該受體的酪氨酸激酶活性，可以促進(jìn)多種細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化，并促新生血管、動(dòng)員細(xì)胞和組織再生等，對(duì)缺血性心臟病有較好的治療作用[13]。

HGF是一種強(qiáng)有力的生長(zhǎng)因子，能夠提高缺血心肌細(xì)胞的存活率[14]，Heeschen等[15]的研究顯示，HGF水平增高急性冠脈綜合征（ACS）患者較其水平低者惡性事件發(fā)生率降低，可預(yù)測(cè)ACS者危險(xiǎn)事件的發(fā)生。 戚游等[16]發(fā)現(xiàn)血漿 HGF、TNF-α、IL-10的差異與青年腦梗死患者預(yù)后密切相關(guān)，并認(rèn)為其可作為預(yù)測(cè)青年腦梗死預(yù)后的有意義指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠應(yīng)用厄貝沙坦4周，觀察到心肌組織缺血得到改善，并于術(shù)后24 h各組大鼠血中均檢測(cè)到HGF含量，對(duì)照組及厄貝沙坦組大鼠HGF呈上升趨勢(shì)，1周時(shí)HGF水平達(dá)到高峰，第2及4周時(shí)HGF水平均較1周時(shí)降低；1、2及4周厄貝沙坦組HGF水平均低于照組，4周時(shí)對(duì)HGF抑制作用更明顯（P＜0.01）。此前筆者觀察到厄貝沙坦對(duì)非ST段抬高心肌梗死 （NSTEMI）者血清HGF存在影響，治療第7天兩組患者血HGF明顯高于治療前（P＜0.05），但厄貝沙坦組明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；兩組患者治療第14天時(shí)HGF水平均較治療第7天下降（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠血HGF水平變化趨勢(shì)及厄貝沙坦對(duì)其影響與人體觀察結(jié)果一致。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)Ad-HGF促進(jìn)c-Kit+癌干細(xì)胞（CSC）增殖和分化使老齡大鼠AMI后心肌修復(fù)，可以推測(cè)AMI患者應(yīng)用厄貝沙坦治療，在早期可使心肌纖維化程度減輕，證實(shí)了早期使用厄貝沙坦對(duì)于心臟功能恢復(fù)的益處。

盡管當(dāng)前在心肌梗死治療領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但其仍然是全球發(fā)病、高死亡率的主要原因[17]。心肌梗死后組織分子、細(xì)胞及間質(zhì)發(fā)生改變，相互間關(guān)系復(fù)雜，共同促進(jìn)心肌梗死后心室重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展[18]。心肌梗死后常伴隨梗死部位纖維化等病理變化，最終導(dǎo)致心功能惡化，已有研究證明RAAS在該過程中扮演重要角色[19]。HGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和形態(tài)改變方面具有重要的作用，并能促進(jìn)血管新生和抑制凋亡，且參與了冠心病的發(fā)生和發(fā)展過程[20]。外周血中HGF細(xì)胞因子的水平變化可直接或間接反映心肌纖維化的病理生理過程[3]。但HGF的基因表達(dá)和作用機(jī)制非常精密和復(fù)雜，在疾病的不同階段可能受不同的病理生理機(jī)制調(diào)節(jié)，厄貝沙坦能夠影響心肌梗死后血中HGF水平，在兩者之間是否存在其他細(xì)胞因子、信號(hào)通路共同參與其中，還不十分明確，尚需進(jìn)一步研究探討。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為厄貝沙坦治療急性心肌梗死提供了新的治療依據(jù)及研究方向。