朱海燕 吳雄健 曾 斌 謝志軍

贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西贛州 341000

肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是慢性肝病進展的中心環(huán)節(jié)[1-2]，人及大鼠的HSC都可表達(dá)低親和力受體（p75 neurotrophin receptor，p75NTR），當(dāng)神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）與p75NTR結(jié)合時可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。本研究主要探討NGF及p75NTR影響HSC增殖及凋亡的可能作用機制，尋找防治肝纖維化的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

NGF及p75NTR購自美國RD公司；AnnexinⅤ-FITC購自美國羅氏公司；P53 and Caspase-3抗體購自武漢博士德公司；S-P超敏試劑盒（鼠/兔）及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清購至美國Gibco公司。HSC系HSC-T6由上海中醫(yī)藥大學(xué)徐列明教授提供，系SV40轉(zhuǎn)染后的大鼠HSC，具有活化HSC表型。

1.2 方法

1.2.1 HSC-T6的培養(yǎng)與傳代 使用DMEM培養(yǎng)液（含100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素，10%胎牛血清）進行培養(yǎng)。設(shè)定培養(yǎng)溫度37℃，CO2濃度5%，濕度飽和。于隔天進行一次換液。待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，以0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶分散細(xì)胞，按1∶4傳代。將其分為對照組、NGF組和NGF+p75NTR組，對照組采用0 ng/ml NGF+0 ng/ml p75NTR，NGF組采用100 ng/ml NGF，NGF+p75NTR 組 采 用 100 ng/ml NGF+100 ng/ml p75NTR。

1.2.2 NGF及p75NTR對HSC-T6增殖的作用 取對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞懸浮液濃度調(diào)至7×104/ml，接種于96孔板中，每孔200 μl，24 h后棄上清，加入各濃度NGF，三組各設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，而后將預(yù)配的XTT比色液50 μl分別加入各孔，置于培養(yǎng)箱中再孵育4 h。使用酶標(biāo)儀測定吸光值（OD值），設(shè)定主波長570 nm，參考波長690 nm。

1.2.3 NGF及P75NTR對HSC-T6凋亡的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞懸液濃度調(diào)至5×105/ml，接種于T-25培養(yǎng)瓶中，24 h后按照分組各培養(yǎng)24 h，收取所有細(xì)胞，取1×106洗滌細(xì)胞，加入100 μl的結(jié)合緩沖液，再加AnnexinⅤ-FITC染液和碘化丙啶（PI）染液各2 μl，在室溫下避光染色30 min，然后再添加結(jié)合緩沖液300 μl，以流式細(xì)胞儀檢測HSC凋亡。

1.2.4 P53及Caspase-3表達(dá)的測定 取對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞懸液濃度調(diào)配至7×104/ml，滴于預(yù)先處理好的置于六孔板內(nèi)的蓋玻片上，每孔0.4 ml，孵育24 h，分組后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后以4%多聚甲醛固定細(xì)胞，分別使用P53及Caspase-3一抗，應(yīng)用SP法進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下胞膜或胞漿或胞核呈棕黃色的為陽性細(xì)胞。每張切片在400×光鏡視野下共取10個視野，計數(shù)各自陽性細(xì)胞所占比例。以各陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)來表示相應(yīng)蛋白的陽性表達(dá)率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較

各組與HSC-T6作用24h后，對照組OD值為0.73±0.01，高于NGF組的0.65±0.03及NGF+p75NTR組的0.40±0.04，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NGF 組與NGF+p75NTR組對HSC的增殖抑制作用比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況比較

各組與HSC-T6作用24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，對照組凋亡率[（6.88±1.35）%]低于 NGF 組和 NGF+p75NTR 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NGF+p75NTR 組的凋亡率為（37.69±2.30）%，較 NGF 組凋亡率[（26.36±8.51）%]明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖 1）。

圖1 NGF及p75NTR誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)觀察

2.3 P53及Caspase-3蛋白的表達(dá)的變化

各組與HSC-T6作用24 h后，NGF組和NGF+p75NTR組的P53、Caspase-3表達(dá)與對照組比較有明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中NGF+p75NTR組升高較NGF組明顯，差異 有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1，圖 2～圖 4）。

表1 NGF及p75NTR處理HSC后Caspase-3、P53表達(dá)陽性細(xì)胞率的比較（%）

圖2 P53細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果（S-P法，400×）

圖3 Caspase-3細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果（S-P法，400×）

圖4 空白對照組（S-P法，400×）

3 討論

肝纖維化是肝硬化的早期病理改變和必經(jīng)階段，是由各種致病因素導(dǎo)致肝臟慢性損傷。目前的研究結(jié)果認(rèn)為，各種致病因素?fù)p傷肝細(xì)胞后，Kupffer細(xì)胞被激活，分泌出多種細(xì)胞因子，共同作用于HSC，最終導(dǎo)致肝纖維化[4-6]。HSC的活化和增殖是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展進程中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；罨疕SC已成為防治肝纖維化的主要靶細(xì)胞之一，誘導(dǎo)活化HSC凋亡是防治肝纖維化的一個重要策略[7-9]。

NGF不僅可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，還可阻斷四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，減輕肝組織炎癥[10-11]，NGF需通過p75NTR介導(dǎo)才可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。p75NTR介導(dǎo)的凋亡機制與多種細(xì)胞因子、激酶有關(guān)，其中絲裂原相關(guān)的蛋白激酶（MAPK）、半胱天冬酶（Caspase）等作用重要。研究發(fā)現(xiàn)肝臟受損的情況下肝細(xì)胞可表達(dá)NGF，用重組體NGF培養(yǎng)HSC，細(xì)胞凋亡明顯增多，且具有劑量依賴性，該作用可能通過調(diào)節(jié)NF-κB活性及PI3K/AKT信號通路而實現(xiàn)[13-15]。Caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)分子，常被作為研究細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子[16]。在P53缺乏時，肝損傷產(chǎn)生更少的衰老細(xì)胞，并相應(yīng)增加了HSCs的激活、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和間質(zhì)纖維化[17]。作者前期研究結(jié)果也顯示，經(jīng)NGF作用的大鼠HSC，可抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制HSC合成Ⅰ、Ⅲ型膠原[18-19]。NGF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與使凋亡相關(guān)基因Caspase-3、P53表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)有關(guān)[20]。NGF聯(lián)合p75NTR的作用特點為針對不同靶細(xì)胞可能分別或共同發(fā)揮兩種相反的作用，誘導(dǎo)凋亡或促進存活。在既往研究中，多為分別觀察HSC中NGF或p75NTR的表達(dá)改變，有關(guān)研究結(jié)果甚至有相互矛盾之處，多認(rèn)為NGF或p75NTR對HSC具有誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究在既往研究基礎(chǔ)上，加入p75NTR及NGF共同作用于HSC，結(jié)果顯示NGF＋p75NTR組相較單純NGF組對HSC的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用更加明顯，可進一步增加凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、P53的表達(dá)，提示NGF與其p75NTR對于HSC的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡具有協(xié)同作用，NGF可能通過p75NTR從而誘導(dǎo)HSC凋亡及抑制其增殖，機制可能與調(diào)節(jié)Caspase-3、P53的表達(dá)有關(guān)。

目前關(guān)于NGF如何誘導(dǎo)HSC凋亡機制研究較少，本研究結(jié)果希望對今后進一步研究NGF作用于HSC的相關(guān)分子機制提供前期實驗基礎(chǔ)，為防治肝硬化及肝纖維化提供新的路徑。