徐成飛，韋立群，李通，潘曉航，甘嘉亮

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

染料木素又稱(chēng)染料木黃酮，分布于豆科植物中的一種天然異黃酮類(lèi)藥物[1]，具有多種生物活性，多種體內(nèi)外試驗(yàn)中有明確的抗炎活性[2-3]，但在炎癥腸病（inflammatory bowel disease, IBD）中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。研究表明結(jié)腸上皮細(xì)胞與腸道免疫功能之間“crosstalk”在炎癥腸病中有著重要意義[4]，同時(shí)在IBD中腸上皮細(xì)胞與腸道中免疫細(xì)胞可能起到類(lèi)似的作用[5-6]。所以本研究利用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和人干擾素γ（human interferon-gamma, hIFN-γ）誘導(dǎo)HT29細(xì)胞產(chǎn)生炎癥模型，探討染料木素是否具有抑制炎癥的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HT29購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所，染料木素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium, DMEM）購(gòu)自中國(guó)維森特生物技術(shù)有限公司，噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購(gòu)自澳大利亞Excellbio公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNase H Plus） 購(gòu) 自 日 本 TaKaRa公司，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢華美生物科技有限公司，p-Akt（S473）、Akt、p-p65、p65 及 GAPDH 兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞分組及處理

A組為對(duì)照組：加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；B組為模型組：給予IFN-γ20 ng/ml孵育12 h，再加入1 μg/ml LPS孵育4 h；C-E組為觀察組：在模型組的基礎(chǔ)上給予不同濃度的染料木素（25、50及100 μmol/L）孵育24 h。

1.3 HT29細(xì)胞培養(yǎng)

HT29細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（10%的胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）于37℃的5% 二氧化碳CO2孵育箱中培養(yǎng)。采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞增殖觀察

采用的MTT方法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，以4×103個(gè)/孔接種到96孔板中。待細(xì)胞貼壁后并分加入染料木素（0、25、50、100及200 μmol/L），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。放置于5% CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后，每孔加入二甲基亞砜150 μl避光在微量震蕩器上震蕩15 min，490 nm的酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.5 白細(xì)胞介素的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time-polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測(cè)白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6, IL-6）、白細(xì)胞介素8（interleukin-8,IL-8）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10, IL-10）的表達(dá)量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，按1.2分組及方法收集細(xì)胞。依照美國(guó)Invitrogen公司RNA試劑提取盒進(jìn)行RNA提取，定量后按照逆轉(zhuǎn)錄TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版進(jìn)行擴(kuò)增，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：50℃孵育2 min，95℃活化10 min 1個(gè)循環(huán)，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。基因相對(duì)表達(dá)量使用2-△△Ct進(jìn)行分析。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-8的含量

用ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。收集1.2的分組方法培養(yǎng)的細(xì)胞液上清液，在4℃低溫離心機(jī)以2 000 r/min速度，離心5 min，收集上清液，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。檢測(cè)時(shí)按華美ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞上清中的IL-8含量的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測(cè) p-Akt（S473）、Akt、p-p65、p65蛋白表達(dá)

收集1.2的分組方法培養(yǎng)的細(xì)胞，用RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF）、Cocktail提取各組細(xì)胞總蛋白量，使用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)樣品蛋白濃度。用10%分離膠60 V恒壓電泳，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜進(jìn)行半干轉(zhuǎn)，5%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）封閉1 h。分別加入稀釋為1∶1 000的p-Akt（S473）、Akt、p-p65、p65 及 GAPDH 抗體 4℃搖床過(guò)夜，在室溫避光孵育熒光二抗2 h，濃度為（1∶10 000），使用雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜。用Image J進(jìn)行蛋白灰度值的分析處理，目的蛋白比上內(nèi)參GAPDH作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染料木素對(duì)HT29增殖的影響

不同濃度染料木素作用HT29細(xì)胞24 h細(xì)胞的增殖率分別為：100%、（99.34±2.67）%、（99.46±3.80）%、（98.42±0.70）%和（94.36±2.28）%，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.869，P=0.080）。200 μmol/L以下濃度的染料木素對(duì)HT29的增殖幾乎無(wú)影響。后續(xù)研究采用25、50及100 μmol/L作為藥物實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2 各組HT29細(xì)胞中炎癥因子mRNA的表達(dá)量

5組IL-1β、IL-6及IL-10的mRNA相對(duì)表達(dá)量經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.486、1.650及1.433，P=0.278、0.237及0.293）。5組IL-8的mRNA相對(duì)表達(dá)量經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=172.048，P=0.000）；模型組較對(duì)照組表達(dá)IL-8高（P＜0.05），觀察組IL-8表達(dá)較模型組低（P＜0.05）。見(jiàn)表 2。

2.3 各組HT29細(xì)胞上清液中IL-8的含量

各組上清液IL-8含量分別為（112.66±7.23）、（1 420.69±76.74）、（1 258.66±93.07）、（845.77±117.06）及（446.95±72.73）pg/ml，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=133.204，P=0.000）。模型組比對(duì)照組上清液表達(dá)IL-8高（P＜0.05），觀察組上清液IL-8表達(dá)量較模型組低（P＜0.05）。

表2 IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10的mRNA相對(duì)表達(dá)量情況 （±s）

表2 IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10的mRNA相對(duì)表達(dá)量情況 （±s）

注：A：對(duì)照組；B：模型組；C-E分別為模型組加入不同染料木素濃度的觀察組（25、50及100 μmol/L）。1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 IL-1β IL-6 IL-8 IL-10 A 1 1 1 1 B 1.08±0.14 1.04±0.03 219.72±18.691） 1.04±0.04 C 1.09±0.11 1.01±0.01 121.21±18.582） 1.05±0.03 D 1.03±0.21 1.03±0.02 28.89±3.202） 1.05±0.04 E 1.33±0.31 1.04±0.04 23.54±2.802） 1.04±0.02 F值 1.486 1.650 172.048 1.433 P值 0.278 0.237 0.000 0.293

2.4 染料木素對(duì)HT29細(xì)胞炎癥模型Akt/NF-κB（p65）通路蛋白表達(dá)的影響

各組p-Akt（S473）和p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=100.430、76.321，均P=0.000），模型組 p-Akt（S473）和 p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組高（P＜0.05），觀察組p-Akt（S473）和p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比模型組低（P＜0.05）。各組Akt和p65的蛋白相對(duì)表達(dá)量經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.463和1.361，P=0.762和0.314）。見(jiàn)附圖和表3。

表3 染料木素對(duì)Akt/NF-κB（p65）通路蛋白表達(dá)的影響 （n =3，±s）

表3 染料木素對(duì)Akt/NF-κB（p65）通路蛋白表達(dá)的影響 （n =3，±s）

注：A：對(duì)照組；B：模型組；C～E分別為模型組加入不同染料木素濃度的觀察組（25，50及100 μmol/L）。1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 p-Akt Akt p-p65 P65 A 0.234±0.024 0.814±0.003 0.293±0.071 0.841±0.008 B 0.828±0.0191） 0.816±0.008 0.858±0.0421） 0.848±0.003 C 0.750±0.0432） 0.812±0.003 0.753±0.0162） 0.847±0.005 D 0.632±0.0292） 0.815±0.004 0.618±0.0422） 0.847±0.001 E 0.491±0.1002） 0.818±0.008 0.448±0.0372） 0.849±0.003 F值 100.430 0.463 76.321 1.361 P值 0.000 0.762 0.000 0.314

附圖 染料木素對(duì)Akt/NF-κB（p65）蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

IBD是累及胃腸道的慢性非特異性炎癥，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病[6]，西方發(fā)達(dá)國(guó)家是該病的主要發(fā)生區(qū)域，僅在北美地區(qū)約有150萬(wàn)的患者[1]，但在過(guò)去的10年，亞洲患病人數(shù)增加1倍[7]，提示該病在世界范圍內(nèi)逐漸擴(kuò)展。目前，IBD的發(fā)病機(jī)制及病因仍不明確，可能與免疫、精神、遺傳等有關(guān)，藥物控制是其主要的治療方法，包括氨基水楊酸、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物[8]，其目的是緩解癥狀，改善患者的生活質(zhì)量[9]。傳統(tǒng)這類(lèi)藥物治療會(huì)引一系列嚴(yán)重的副作用，如骨髓抑制、肝腎功能損害等[10]。因此，有必要尋找副作用少新的替代藥物。

染料木素于1899年從染料花中分離出來(lái)，廣泛分布在豆科植物中，具有抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[1]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)它具有抗炎作用。EO等[2]發(fā)現(xiàn)，喂食染料木素可以降低用四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠的延遲損傷修復(fù)過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，并可以減輕炎癥因子的釋放。王小倩等[3]在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)染料木素可以促進(jìn)AMPKα磷酸化抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7表達(dá)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factors, TNF-α）、IL-6。炎癥腸病的慢性炎癥可能是由于促炎因子異常持續(xù)分泌而導(dǎo)致[11]，而IL-8是主要的趨化因子之一。IL-8可以激活中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)多種促炎因子，如：IL-6、TNF-α、IL-1β[11-12]。本研究結(jié)果顯示，IL-8 mRNA表達(dá)升高，而IL-1β、IL-6、IL-10無(wú)變化。ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-8蛋白表達(dá)也升高，提示細(xì)胞炎癥模型是成功的。在此基礎(chǔ)上，后續(xù)給予不同濃度的染料木素處理，結(jié)果顯示染料木素能抑制IL-8 mRNA表達(dá)和細(xì)胞上清中IL-8蛋白表達(dá)，提示染料木素可能具有一定的抗炎活性。

LPS是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁組成部分，在許多實(shí)驗(yàn)中可用來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[13]。LPS能夠特異性識(shí)別表達(dá)在巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞細(xì)胞等表面的Toll樣受 體 4（toll-like receptors 4, TLR4）[14]。TLR4識(shí) 別LPS后誘導(dǎo)髓樣分化因子88（myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88）依賴(lài)性細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，MyD88召集IL-1受體相關(guān)激酶（IL-1 receptor-associated kinases, IRAKs）、 腫 瘤 壞 死 因子受體相關(guān)因子6（tumor-necrosis factor receptorassociated factor 6, TRAF6），從而激活核因子κB激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK）復(fù)合體，IKK磷酸化后介導(dǎo)NF-κB激活，處在包質(zhì)中的NF-κB被激活后轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)活性，使IL-8、IL-1β、TNF-α基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)而高表達(dá)[15]，持續(xù)大量的NF-κB激活與炎癥程度呈正相關(guān)。所以NF-κB活性是炎癥程度的一個(gè)重要指標(biāo)。Akt是NF-κB上游激活的信號(hào)激活，他們?cè)谡{(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移中起重要的作用[16]，活化的Akt也能激活NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，促使相關(guān)炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)[17]。本研究免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著濃度的增大，染料木素逐漸抑制p-Akt（S473）/p-p65的活性，提示染料木素對(duì)Akt/NF-κB通路具有抑制作用。

綜上所述，染料木素能抑制LPS和hIFN-γ誘導(dǎo)HT29細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制Akt/NF-κB通路有關(guān)。為深入研究染料木素抗炎作用提供一定的理論基礎(chǔ)。