郭錦翠，張艷艷，楊振邦，牛澤人，張雪梅

（1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063000）

腫瘤是全人類面臨的一個(gè)巨大公共衛(wèi)生問(wèn)題，肺 癌在所有惡性腫瘤死因中居首位[1]。腫瘤發(fā)生的主要原因之一是腫瘤對(duì)補(bǔ)體監(jiān)視的免疫逃避[2]。膜結(jié)合性補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（membrane-bound complement regulatory proteins, mCRPs）在機(jī)體內(nèi)能夠與補(bǔ)體相互作用，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)補(bǔ)體的激活與抑制，在保護(hù)自身組織的同時(shí)還能有效殺滅外來(lái)有害成分[3]。CD59作為mCRPs中重要成分之一，與炎癥、創(chuàng)傷及某些腫瘤等疾病有密切的關(guān)系[4-5]。研究表明，CD59在乳腺癌[5-6]、結(jié)腸癌[7]、肺癌組織[8]中顯現(xiàn)出高表達(dá)。

基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）是人群中普遍存在的核苷酸改變，而啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性影響基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平的改變，導(dǎo)致腫瘤和疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。本研究旨在探討CD59啟動(dòng)子區(qū)遺傳變異對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒pGL3-Basic、pRL-SV40以及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、凝膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，LipofectamineTM2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、NheⅠ和連接酶T4 DNA分別購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs和日本TaKaRa公司。A549、NCI-H2030、NCI-H23非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 啟動(dòng)子區(qū)SNP篩選 對(duì)國(guó)際共享數(shù)據(jù)庫(kù)Ensembl中基因CD59啟動(dòng)子區(qū)SNP信息進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，將CD59基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游擴(kuò)展1 500 bp，篩選出可影響基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的SNP位點(diǎn)，規(guī)定在中國(guó)人群中的最小等位基因頻率不＞0.05，采用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（www.gene-regulation.com）中的軟件TRANSFAC分析軟件預(yù)測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合有影響的SNP位點(diǎn)，最終共篩選出1個(gè)SNP位點(diǎn)（CD59 rs79077373）。

1.2.2 CD59啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因載體構(gòu)建與鑒定 使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，CD59啟動(dòng)子區(qū)PCR擴(kuò)增所用引物序列：正向5'-GGGGTACCCCTC AAGCAACGCAAACTAC-3'，反向5'-CTAGCTAGCTA GCCCCCGCATTCTTTCGCT-3'。該P(yáng)CR產(chǎn)物長(zhǎng)2 282 bp（-2 234 bp，+47 bp）引物兩端分別加上酶切位點(diǎn)KpnⅠ、NheⅠ及對(duì)應(yīng)的保護(hù)堿基。

調(diào)整PCR儀器反應(yīng)程序，將反應(yīng)體系離心6 s，立即放置到PCR儀，進(jìn)行片段的擴(kuò)增，一般在94℃的溫度條件下預(yù)變性10 min，然后進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：第1階段為94℃變性45 s，第2階段為61.5℃退火45 s，第3階段為72℃延伸2 min，這3個(gè)階段進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)完成后進(jìn)行10min的72℃延伸。將擴(kuò)增片段切膠回收，使用KpnⅠ、NheⅠ進(jìn)行雙酶切后與pGL3-Basic報(bào)告基因載體進(jìn)行連接。隨后將連接后的產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成腸桿菌DH5α，接著挑取其中的陽(yáng)性單克隆，最后進(jìn)行測(cè)序的確認(rèn)，構(gòu)建完成的質(zhì)粒定點(diǎn)突變由蘇州泓迅生物技術(shù)有限公司完成，根據(jù)測(cè)序結(jié)果將重組質(zhì)粒分別標(biāo)記為pGL3-rs79077373C和pGL3-rs79077373T。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1天將狀態(tài)良好的A549、NCI-H23和NCI-H2030以每孔2×105個(gè)細(xì)胞均勻接種到板中，當(dāng)密度到70%后，根據(jù)使用說(shuō)明書轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況為：800 ng的重組質(zhì)粒（pGL3-rs79077373C或pGL3-rs79077373T）和10 ng的內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40，每組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞至少設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)的復(fù)孔，每次以相同的條件相同的試劑至少重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)24 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后收集細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。

1.2.4 雙熒光素酶活性檢測(cè) 根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行操作并設(shè)定發(fā)光檢測(cè)儀，型號(hào)為Glo Max 20/20。600 μl PBS清洗，加100 μl PLB裂解液，室溫下輕搖板15 min，將裂解液移至EP管中，瞬時(shí)離心后進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。EP管中加入50 μl LAR Ⅱ和15 μl裂解產(chǎn)物，F(xiàn)值即Firefly熒光素酶活性應(yīng)被即刻檢測(cè)，隨后50 μl 1×Stop &Glo溶液被立即加入到24孔板中，R 值即Renilla熒光素酶活性，計(jì)算熒光素酶活性即F值與R值之比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（www.gene-regulation.com）中的軟件TRANSFAC分析預(yù)測(cè)CD59 rs79077373 C/T遺傳變異對(duì)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)影響（見(jiàn)圖1）。無(wú)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的情況是當(dāng)該位點(diǎn)為C等位基因時(shí)；當(dāng)該位點(diǎn)出現(xiàn)T等位基因，此時(shí)存在轉(zhuǎn)錄因子TBP與之結(jié)合。因此采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，探討生物學(xué)意義。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)rs79077373 C/T對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的影響

2.2 CD59基因啟動(dòng)子區(qū)重組質(zhì)粒結(jié)果驗(yàn)證

CD59重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后rs79077373位點(diǎn)為C等位基因，將其命名為pGL3-rs79077373C，利用構(gòu)建好的重組質(zhì)粒將rs79077373位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變后的重組質(zhì)粒命名為pGL3-rs79077373T。重組質(zhì)粒利用雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，酶切片段與插入片段長(zhǎng)度相符（見(jiàn)圖2A）。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果利用Blast與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中CD59基因啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)，一致性為100%（見(jiàn)圖2B）。

圖2 CD59基因啟動(dòng)子區(qū)載體構(gòu)建結(jié)果驗(yàn)證

2.3 熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)

將 重 組 質(zhì) 粒 pGL3-rs79077373C、pGL3-rs79077373T、空質(zhì)粒pGL3-Basic分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRLSV40共 轉(zhuǎn) 染 于 NCI-H2030、NCI-H23、A549 3株非小細(xì)胞肺癌后，熒光素酶活性的表達(dá)情況檢測(cè)見(jiàn)圖3。重組質(zhì)粒熒光素酶相對(duì)活性經(jīng)對(duì)照組校正，每組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，數(shù)據(jù)由3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)得出，用（±s）表示每組數(shù)值。A549細(xì)胞中，pGL3-rs79077373T組的熒光素酶相對(duì)活性值為（17.95±0.50），pGL3-rs79077373C組的熒光素酶相對(duì)活性值為（8.99±0.56），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-20.639，P=0.000），pGL3-rs79077373T組的熒光素酶相對(duì)活性值為pGL3-rs79077373C組的2.00倍。NCI-H23細(xì)胞中，pGL3-rs79077373T組的熒光素酶相對(duì)活性值為（18.89±1.13），pGL3-rs79077373C組的熒光素酶相對(duì)活性值為（10.36±0.44），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-12.150，P=0.000），pGL3-rs79077373T 組的熒光素酶相對(duì)活性值為pGL3-rs79077373C組的1.82倍。NCIH2030細(xì)胞中，pGL3-rs79077373T組的熒光素酶相對(duì)活性值為（6.17±0.71），pGL3-rs79077373C組的熒光素酶相對(duì)活性值為（4.36±0.43），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.752，P=0.020），pGL3-rs79077373T組的熒光素酶相對(duì)活性值為pGL3-rs79077373C組的1.42倍。

圖3 CD59基因rs79077373報(bào)告基因熒光素酶相對(duì)活性

3 討論

CD59又稱保護(hù)素，位于人類11號(hào)染色體長(zhǎng)臂，其糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定到細(xì)胞膜表面。CD59蛋白的功能突出表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①CD59通過(guò)與C8和（或）C9結(jié)合、干擾C9插入細(xì)胞膜內(nèi)或C9的多聚化，進(jìn)而阻斷補(bǔ)體攻膜復(fù)合物（MAC）的裝配，保護(hù)宿主細(xì)胞免于受補(bǔ)體的溶破[10]。②CD59可以作為第二信號(hào)刺激物，一方面可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的激活，另外參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)過(guò)程[11]。③CD59作為CD2的配體能夠與CD2相結(jié)合形成CD59-CD2復(fù)合物，隨后激活T細(xì)胞并且誘導(dǎo)T細(xì)胞及其他組織細(xì)胞的黏附，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。

CD59在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)可能有助于腫瘤逃避免疫監(jiān)視和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解。CD59在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，與結(jié)直腸癌的臨床分化和病理分期明顯相關(guān)，并且CD59沉默的結(jié)腸癌細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)對(duì)化療藥物的敏感性[7，13]。在乳腺癌研究中，CD59表達(dá)明顯增加并且CD59的缺失可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的CD59基因表達(dá)后，F(xiàn)as和Caspase-3的表達(dá)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)降低，從而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡和生長(zhǎng)抑制[14]。在CD59與肺癌關(guān)系的研究中[8，15]，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)CD59在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)要高于正常肺組織細(xì)胞，補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的裂解作用被抑制，CD59的高表達(dá)可能是腫瘤細(xì)胞逃避補(bǔ)體攻擊和抵制單克隆抗體治療肺癌的重要原因，提示CD59是腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展的主要因素之一。

本研究證實(shí)，CD59啟動(dòng)子區(qū)SNP rs79077373 T等位基因可增加CD59的啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性，說(shuō)明CD59啟動(dòng)子區(qū)遺傳變異可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控其表達(dá)，為深入研究CD59基因在腫瘤中高表達(dá)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。