薛洪省，韓 麗，李建新，錢海利，趙志龍

（1大連大學附屬中山醫(yī)院，遼寧大連116600；2中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學國家重點實驗室，北京100021）

0 引言

肺癌作為人類癌癥致死的首要原因，其中小細胞肺癌（small cell lung cance，SCLC）約占肺癌總數(shù)的13%［1］，對于老年抽煙患者是一種死亡率較高的疾病。其腫瘤細胞生長迅速、早期轉移以及早期對化療藥物出現(xiàn)耐藥等問題均可以影響臨床治療效果。近40年間，無論外科手術還是化學藥物在預后方面均未取得滿意效果［2］。通過對SCLC分子生物學的研究，其惡性生物學行為逐步被揭示，新的化學藥物以及靶向藥物已經(jīng)成為研究熱點。

肺癌形成是由于在基因轉錄過程中堿基異常錯配所引起的長期累積結果。在多種惡性性腫瘤中均普遍高表達腫瘤轉移相關蛋白1（metastasis associated protein 1， MTA1）［3－4］。 MTA 家族包括 6 個不同亞型，分 別 為： MTA1、 MTA1s、 MTA1?ZG29p、 MTA2、MTA3及 MTA3L［5］。MTA1作為染色質核重塑和核小體去乙?；飶秃象w（NuRD復合體）成員之一，主要通過調控靶基因染色質重構影響基因轉錄［6］。研究［7］提示，人類多種惡性腫瘤如乳腺癌、口腔鱗癌、食管鱗癌、結腸癌、非小細胞肺癌（non?small cell lung cance，NSCLC）均與MTA1過表達密切相關。然而，SCLC中有關MTA1研究尚少，主要發(fā)病機制尚未明確。為了研究SCLC中MTA1的表達及功能機制，我們通過人SCLC及正常肺組織芯片、肺癌細胞株及MTA1轉基因小鼠探索MTA1在體內外的表達、功能及作用機制。

1 材料和方法

1．1 SCLC及正常肺組織石蠟包埋組合芯片芯片中包含SCLC組織40例，正常肺組織10例，每張芯片中包含2點相同的組織標本（西安艾麗娜生物公司、附TNM和臨床分期）。

MTA1和 SOX2染色強度評分：0（陰性）、1（弱陽性）、2（中陽性）、3（強陽性）；MTA1 和 SOX2 染色陽性細胞百分比評分：0（0%～10%）、1（＞10%～25%）、2（＞25%～50%）、3（＞50%～75%）、4（＞75%～100%）。染色評分為染色強度評分和染色陽性細胞百分比評分的乘積［8］。＞8分為強表達，≤8分為弱表達。

1．2 細胞系及培養(yǎng)條件人SCLC細胞系NCI?H446，人 NSCLC 細胞系 NCI?A549 和 NCI?H1650，均由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學國家重點實驗室保存并提供。細胞培養(yǎng)基為含10%小牛血清、盤尼西林（100 U／mL）、鏈霉素（100 mg／mL）的 RPMI 1640。細胞孵育在含有5%CO2，37℃的濕潤培養(yǎng)箱中。

1．3 MTA1小干擾RNA轉染MTA1小干擾RNA（MTA1?siRNA）和陰性對照 siRNA（NC?siRNA，上海吉瑪制藥技術有限公司）按照試劑操作說明書進行，其中空白對照組（mock）為僅加入Lipofectamine2000（Invitrogen公司）轉染試劑。

1．4 聚合酶鏈反應（PCR） 使用Trizol試劑按照試劑操作說明提取細胞RNA。MTA1擴增的有義引物5′?CAGCTACGAGCAGCACAACG?3′和 反 義 引 物 5′?TGTCCGTGGTTTGCCAGA?3′。 內參磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的有義引物 5′?GGTGGTCTCCTCTGACT?TCAACA?3′和 反 義 引物 5′?GTTGCTGTAGCCAAAT?TCGTTGT?3′。 PCR 條件：預變性 94℃ 60 s，40 個循環(huán)，94℃ 60 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s。

1．5 免疫印跡分析（western blot） 組織及細胞蛋白提取、濃度測定、凝膠電泳、轉膜、封閉后分別與抗MTA1多克隆抗體（1 ∶1000，Abcam），抗?β?actin 單克隆抗體（1 ∶10000，Abcam），抗 E?cadherin 多克隆抗體（1 ∶1000，Abcam），抗?PARP 多克隆抗體（1 ∶1000，Cell Signaling），抗?puma 多克隆抗體（1 ∶1000，Cell Signaling），抗?CyclinD1 多克隆抗體（1 ∶500，BIO?WORLD），抗?CyclinE1 多克隆抗體（1 ∶500，BIO?WORLD），抗?SOX2 多克隆抗體（1 ∶1000，Abcam），抗?OCT4多克隆抗體（1∶1000，Abcam）進行封閉雜交，然后分別和對應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5000）室溫雜交孵育，最后通過 LAS?4000自動曝光系統(tǒng)進行結果檢測。

1．6 細胞增殖實驗將3×103細胞／孔接種于含有完全培養(yǎng)基中的96孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為100 μL的不含血清培養(yǎng)基及10 μL的MTS試劑混合液，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后利用酶標儀測定培養(yǎng)板各孔在λ＝490 nm處的吸光度。

1．7 細胞克隆實驗使用完全培養(yǎng)基將收獲轉染48 h后的細胞懸浮成1×103個細胞／mL，然后在6孔板中分別加入0．5 mL的懸浮液及2．5 mL完全細胞培養(yǎng)基，搖勻后靜置于培養(yǎng)箱中10 d，然后用含0．2%結晶紫染料固定染色10 min，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照分析。

1．8 免疫組化組織固定、包埋、切片后經(jīng)烤片、石蠟脫水、抗原修復、沖洗、封閉。加入抗MTA1多克隆抗體（1 ∶100，Abcam）、抗 SOX2多克隆抗體（1 ∶100，Abcam）4℃避光孵育過夜，洗滌后取PV?9000 Immu?no?Bridge免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物公司）按照操作說明書進行。進行DAB顯色。顯色充分后終止反應。復染、反藍、脫水、中性樹脂封片。

1．9 轉基因小鼠MTA1轉基因小鼠由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學國家重點實驗室保存并提供，實驗室使用許可證［SYSKS（京）2008?0025］。 動物實驗得到中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員批準（ILAS?002），MTA1轉基因小鼠具體制備步驟見文獻［9］。

1．10 統(tǒng)計學處理統(tǒng)計學分析采用均值和T檢驗，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 SCLC組織和細胞中MTA1呈高表達狀態(tài)在SCLC細胞NCI?H466中，通過 PCR及 western blot檢測到MTA1高表達，且較NSCLC細胞系NCI?A549及NCI?H1650表達水平顯著增高（圖1A）。利用包括40例SCLC組織和10例正常肺組織的組織芯片（圖1B），進行免疫組化染色，顯示SCLC中的MTA1表達評分較正常肺組織顯著增高（P＝0．003，圖 1C）。同時，SCLC 組織 MTA1表達在性別（P＝0．399）、年齡（P＝0．999）、腫瘤分期（T 分期：P ＝0．478、N 分期：P＝0．814、M 分期：P ＝ 0．119）各亞組中無顯著差異（表 1）。

圖1 SCLC組織芯片及細胞系中MTA1呈高表達狀態(tài)

表1 MTA1蛋白表達與SCLC患者臨床病理特征的關系［n（%）］

2．2 下調MTA1表達后，SCLC細胞增殖能力明顯下降對比 NC?siRNA組，MTA1?siRNA組的 SCLC細胞中MTA1表達水平明顯下調（圖2A、B），同時，SCLC細胞增殖能力（P＝0．022）和細胞克隆形成能力（P＝0．038）顯著降低（圖 2C、D）。

圖2 下調MTA1表達后，SCLC細胞增殖能力明顯下降

2．3 MTA1表達下調后，SCLC細胞惡性生物學能力顯著下降對比 NC?siRNA 組，MTA1?siRNA 組SCLC細胞中E?cadherin蛋白表達量明顯增高。凋亡相關蛋白PUMA表達亦明顯增加，各組中周期相關蛋白cyclin E1和 cyclin D1無明顯變化（圖3）。

圖3 MTA1表達下調后，SCLC細胞惡性生物學能力顯著下降

2．4 MTA1通過調控干細胞轉錄因子2參與SCLC的惡性生物學進程通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)肺癌中與MTA1表達呈正相關的基因約有12 000個，SOX2相關系數(shù)為0．25（圖4A）。免疫組化結果對比正常肺組織，SCLC組織芯片中SOX2染色得分明顯增高（P＝0．015，圖 4B）。 對比 NC?siRNA 組，MTA1?siRNA組SCLC細胞中SOX2蛋白表達量明顯降低，Oct4表達無明顯差異（圖4C）。MTA1轉基因小鼠肺組織MTA1和SOX2蛋白表達量均較野生型小鼠肺組織明顯增高（圖4D、E）。免疫組化結果提示MTA1同SOX2具有緊密的正相關性（r＝0．781，圖4F、G）。

3 討論

Sasaki在 2002年首次在 74例 SCLC中發(fā)現(xiàn)MTA1普遍高表達。因此，推斷MTA1與肺癌的侵襲和轉移過程密切相關［10］。 之后，多項研究［11－14］證實MTA1在NSCLC發(fā)生發(fā)展進程中具有促進作用。MTA1作為染色質重塑及核小體去乙?；瘡秃象w組成部分通過轉錄因子依賴的方式調控靶基因的轉錄表達［15］，促進基因轉錄［16］，增加蛋白質的穩(wěn)定性［17］，涉及DNA的損傷修復［18］，并且正常組織中處于普遍低表達水平［19］。MTA1在腫瘤的浸潤和轉移方面具有重要價值，為評估腫瘤惡性程度、個體化治療及預后判斷指明了方向。

為了探索SCLC中MTA1的表達及功能，實驗證實MTA1在肺癌細胞系中高表達，并且在SCLC細胞系NCI?H446中顯著高表達。通過siRNA下調SCLC中MTA1表達，SCLC的增殖及克隆能力顯著下降，揭示MTA1參與調控SCLC的生長和增殖。MTA1作為轉錄生長因子?β1的下游效應器介導 E?cadherin表達參與腫瘤的侵襲及轉移過程，并發(fā)揮重要作用［20］。惡性腫瘤中E?cadherin蛋白表達缺失表現(xiàn)為腫瘤生長迅速、早期轉移、預后不良等［21］。下調MTA1表達后E?cadherin表達顯著上調，表明MTA1通過調控E?cadherin參與腫瘤細胞的侵襲轉移。在DNA損傷修復方面，MTA1通過最為常見的PARP依賴途徑參與DNA損傷修復［20］。本研究通過下調MTA1后PARP出現(xiàn)了顯著的凋亡帶，Puma呈高表達，提示SCLC中MTA1通過PARP依賴方式參與DNA損傷修復。惡性腫瘤中MTA1過表達可激活cyclin D1通路［23］，cy?clin D1及cyclin E1表達無明顯變化，原因可能是SCLC中MTA1調控細胞周期相關蛋白的作用機制不同。推斷MTA1在不影響SCLC細胞周期的方式下參與整個腫瘤進程。

圖4 MTA1通過參與腫瘤干細胞調控促進腫瘤惡性生物學行為

腫瘤發(fā)生、發(fā)展的整個過程中均涉及腫瘤干細胞［24］。SOX2作為HMG DNA結合域轉錄因子家族中的成員對胚胎干細胞全能性的發(fā)育起著重要作用，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關［25］。SOX2在人類食管癌、NSCLC、SCLC 中呈現(xiàn)普遍高表達［26－28］。 研究［29］發(fā)現(xiàn)SOX2參與腫瘤干細胞進程，并促進了腫瘤細胞的生長，下調SOX2表達后細胞生長受到明顯抑制。既往研究［30］表明過表達MTA1和SOX2后腫瘤表現(xiàn)為高侵襲性及高轉移性生長方式。在TCGA數(shù)據(jù)庫中通過分析發(fā)現(xiàn)總體肺癌中MTA1與SOX2呈中等相關性。至今，在SCLC中仍沒有關于MTA1與SOX2之間相互關系的可用數(shù)據(jù)。 研究［3，31－32］提示 MTA1 通過復雜的信號通路激活上皮間質轉化（epithelial?mes?enchymal transition，EMT），同樣有研究證實SOX2也參與了EMT過程。EMT在腫瘤干細胞特征維持方面處于基礎地位，并在腫瘤侵襲轉移過程中發(fā)揮重要作用［33］。SCLC組織芯片結果提示腫瘤組織較正常組織MTA1顯著增高，但在性別、年齡、腫瘤TNM分期等亞組中MTA1表達無明顯差異，提示SCLC中MTA1普遍高表達，亦不排除病例數(shù)少造成的統(tǒng)計誤差。SCLC組織芯片結果提示MTA1與SOX2表達呈正相關，表明MTA1可能通過調控SOX2涉及到腫瘤干細胞的調控過程中。對比野生型小鼠，MTA1轉基因小鼠肺組織中SOX2顯著高表達，更進一步證實了MTA1與SOX2的正相關性。在TCGA數(shù)據(jù)庫中由于包含了大量NSCLC患者進而造成二者相關性減小，而本研究數(shù)據(jù)彌補了TCGA中關于SCLC部分的空白。至此，在SCLC中提示MTA1可能通過EMT方式調控SOX2。

本研究表明在SCLC中MTA1作為關鍵調控因子通過調控SOX2參與腫瘤干細胞生物學進程，并且在腫瘤的增殖、凋亡方面具有顯著影響。在SCLC惡性進程中發(fā)揮著重要生物學作用，這將有可能為SCLC的治療帶來新的希望。