張瑩瑩，王曉文，唐勁天

（1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤科，湖南 長沙410078；2清華大學(xué)工程物理系醫(yī)學(xué)物理與工程研究所，北京100084）

0 引言

隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，腫瘤治療的技術(shù)也在不斷的進(jìn)步。但是對于很多惡性腫瘤來說，常規(guī)治療效果欠佳，死亡率居高不下，仍是臨床治療中的難點(diǎn)。近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)，部分惡性黑素瘤患者出現(xiàn)腫瘤自發(fā)性的消退現(xiàn)象，于是逐漸關(guān)注黑色素瘤固有的致免疫性。隨著研究的不斷深入，人們將其認(rèn)為是惡性腫瘤中具有高免疫原性的一種。因此，免疫治療開始成為惡性黑色素瘤治療的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向，并期待取得突破性進(jìn)展［1］。

已有研究［2－3］報道熱療可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，且這種增強(qiáng)在很大程度上與熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）的過表達(dá)有關(guān)。大量的實(shí)驗(yàn)研究［4－5］已經(jīng)證實(shí)了經(jīng)熱誘導(dǎo)的癌細(xì)胞中的HSP70、HSP90等物質(zhì)能夠激發(fā)抗腫瘤免疫。然而，眾多熱休克蛋白相關(guān)腫瘤疫苗的動物或臨床研究［6－8］均顯示，雖然在實(shí)驗(yàn)對象體內(nèi)可以檢測到特異性免疫反應(yīng)并且腫瘤生長受到不同程度地抑制，但尚難達(dá)到滿意的療效。分析原因，發(fā)現(xiàn)有可能與MHC?I抗原的表達(dá)不強(qiáng)有關(guān)［9］。甚至有研究［3］表明熱休克處理雖然可以增加抗原肽形成，但同時抑制了抗原的呈遞。B16細(xì)胞經(jīng)熱誘導(dǎo)后，會形成免疫原性的抗原。例如檢測細(xì)胞中的HS，發(fā)現(xiàn)其P?抗原復(fù)合物的含量有所上升，但是MHC?I分子卻不能有效地將抗原傳遞給T細(xì)胞，從而造成免疫耐受或逃逸。因而，比較理想的腫瘤疫苗應(yīng)該能夠有效地激活T細(xì)胞，為其提供良好的第一和第二信號，將其特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)充分發(fā)揮出來［8］，同時也避免由于免疫強(qiáng)度不夠而發(fā)生逃逸，影響患者身體健康。

要想抗原誘導(dǎo)機(jī)體更好地發(fā)生免疫反應(yīng)，可適當(dāng)?shù)靥砑幼魟m當(dāng)?shù)淖魟┠軌驗(yàn)門細(xì)胞的活化提供第二信號。所以在疫苗的研究過程中，對佐劑的研究也是其中很重要的部分。目前使用比較多的佐劑大多是人工合成的，寡聚核苷酸鏈（oligodeoxynucleoti?des，ODN）中含有非甲基化 CpG 基序（CpG?ODN），也是一種近年新引起廣泛關(guān)注的水性佐劑。其自身無免疫原性，不會引起自身免疫疾病。更重要的是CpG?ODN作為Toll樣受體9的配體，能夠提高蛋白抗原和DNA疫苗的免疫原性，直接激活 NK細(xì)胞［10］、樹突狀細(xì)胞［11］、巨噬細(xì)胞［12］等，并刺激這些細(xì)胞分泌 IFN?γ、IL?2、TNF?α 等 Th1 樣細(xì)胞因子，從而誘導(dǎo) Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答［13－14］。 此外，它還能夠在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞抗原呈遞，促進(jìn)其細(xì)胞表面分子MHC?II、B7?1、B7?2 等的表達(dá)，活化樹突狀細(xì)胞，促進(jìn)抗原呈遞，協(xié)同激活 T 細(xì)胞［15－16］。 因此，可將 CpG?ODN作為多種抗原的免疫佐劑，以增強(qiáng)免疫作用［13，15，17－19］，在抗腫瘤免疫治療領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。

綜上所述，富含熱休克蛋白的腫瘤細(xì)胞瘤苗和CpG?ODN在抗腫瘤免疫功能上具有互補(bǔ)性，CpG?ODN有望克服單純腫瘤細(xì)胞疫苗抗原呈遞活性的不足，起到協(xié)同增效的作用。本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪切∈髳盒院谏亓?，腫瘤疫苗選擇經(jīng)過熱誘導(dǎo)且富含HSP70的B16細(xì)胞裂解的產(chǎn)物，聯(lián)合新型免疫佐劑CpG?ODN免疫小鼠，觀察疫苗對小鼠產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用，并研究小鼠免疫系統(tǒng)的功能改變。

1 材料和方法

1．1 主要試劑羊抗鼠HSP70多克隆抗體，購自美國Cellsigna公司；抗羊二抗液，被辣根過氧化物酶標(biāo)記，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，大鼠抗小鼠CD4 R?PE和CD8a TRI?COLOR熒光抗體、大鼠抗小鼠CD25?FITC熒光抗體均購自美國Invitrogen公司；脾淋巴細(xì)胞分離液，購自達(dá)科為生物有限公司；小鼠 IL?2、 IFN?γELISA 試劑盒，購自美國 Bioscience公司；LDH釋放法檢測試劑盒購自美國Promega公司（Madison， WI）。

1．2 實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)小鼠，健康清潔級C57BL／6，雄性，體質(zhì)量18～22 g，6～7周，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠飼養(yǎng)時溫度為（23±2）℃，相對濕度（55%±2%），普食飼養(yǎng)。

1．3 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫。B16細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基，接種之后放于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)約24 h即可進(jìn)行傳代，觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的數(shù)量呈對數(shù)期增長時即可提取用于實(shí)驗(yàn)。

1．4 制備熱處理后細(xì)胞裂解瘤苗將經(jīng)45℃15 min熱處理后的B16細(xì)胞（我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，相較42℃ 60 min和50℃ 5 min，45℃ 15 min熱處理能誘導(dǎo)最高程度的HSP70蛋白表達(dá)，該western blot結(jié)果在補(bǔ)充材料中提供），立即更換培養(yǎng)基后放回37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱復(fù)溫孵育24 h后取出，收集全部細(xì)胞，用PBS將細(xì)胞洗滌兩次，然后將其濃度調(diào)整至5×108個／mL。即可將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至冷凍管中進(jìn)行保存，然后再交替置于液氮內(nèi)10 min，37℃水浴中5 min，多次操作之后待細(xì)胞完全溶解后，即可放于－80℃的環(huán)境中進(jìn)行冷凍保存，以備后用。

1．5 CpG?ODN2395佐劑配制CpG?ODN2395 的序列為 5′?TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG?3′，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。根據(jù)說明書，使用PBS溶解核酸，將濃度調(diào)制為0．1 mL／OD，注意即配即用。

1．6 實(shí)驗(yàn)分組以及小鼠腫瘤疫苗接種及攻擊實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為下述四組。①對照組：接種PBS；②瘤苗組（heated cell lysates，HCL組）：將45℃熱處理腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物（每0．1 mL含2×107個細(xì)胞的裂解產(chǎn)物）＋PBS等體積混合后接種；③佐劑組（CpG?ODN 組）： CpG?ODN2395（濃度為 30 μg／0．1 mL） ＋PBS等體積混合后接種；④聯(lián)合組（HCL＋CpG?ODN組）：將 45℃熱處理腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物＋CpG?ODN2395等體積混合后接種。

健康小鼠的疫苗接種：分別于第 0、6、12、18及24 d向小鼠注射疫苗，需注意疫苗應(yīng)分四點(diǎn)進(jìn)行注射，注射位置為小鼠雙側(cè)腹股溝和腋窩皮下，每個位置的注射量為0．05 mL，每間隔5 d進(jìn)行一次注射，每只小鼠接種5次。

B16細(xì)胞攻擊接種后小鼠：當(dāng)B16細(xì)胞呈對數(shù)生長之后，取細(xì)胞放于0．25%胰酶中進(jìn)行消化。重懸于PBS中。并將 B16的濃度調(diào)至 1×106個／mL，于第30天在小鼠為右肋腹部皮下位置進(jìn)行注射，每只小鼠注射 0．1 mL。

觀察并記錄小鼠皮下腫瘤出現(xiàn)的時間、體積大小和小鼠生存天數(shù)。

1．7 外周血T細(xì)胞亞群檢測免疫結(jié)束后的第六天（d30），隨機(jī)從每組中挑選3只小鼠，用摘眼球取血法采集小鼠血液，并置于抗凝管中。在抗凝管中取血100 μL，置于 1．5 mL 離心管，分別向離心管中加入3 L的，在溫室、避光的環(huán)境中孵育15～20 min。1000 rpm離心 5 min，棄上清。加入 2 mL PBS，1000 rpm離心5 min，將未結(jié)合抗體洗去。在溶液中加入稀釋了的流式紅細(xì)胞裂解液，在溫室、避光的環(huán)境中孵育15 min，觀察發(fā)現(xiàn)溶液呈透明狀后取出。以1000 rpm的速度離心溶液離心5 min，棄上清。向其中加入2 mL PBS，再以1000 rpm的速度離心溶液離心5 min，重復(fù)洗滌2次。加入4%多聚甲醛，固定待測。用流式細(xì)胞儀檢測外周血中CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞以及CD25＋T細(xì)胞的數(shù)量，計算各亞群比例。

1．8 小鼠脾淋巴細(xì)胞分離和培養(yǎng)取血后將小鼠斷頸處死，無菌取脾，置于200目尼龍網(wǎng)中研磨脾組織，分散的細(xì)胞經(jīng)過尼龍網(wǎng)過濾即可進(jìn)入到脾淋巴細(xì)胞分離液中。收集懸液，以1500 rpm的速度離心溶液離心30 min（密度梯度法），得到脾臟單個核細(xì)胞。用PBS液將細(xì)胞漂洗兩次，于5 mL 10%FCS RPMI 1640培養(yǎng)液重懸（含 IL?2 100 U／L），以常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液隔天更換。

1．9 ELISA法檢測小鼠脾細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子IL?2、INF?γ水平將所獲各組小鼠脾淋巴細(xì)胞（單核細(xì)胞）作為效應(yīng)細(xì)胞，以絲裂霉素C滅活處理后B16細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，按10∶1的比例共培養(yǎng)3 d，收集培養(yǎng)上清，ELISA法檢測其中Th1型細(xì)胞因子 IL?2、INF?γ 的水平。

1．10 LDH釋放法檢測免疫后小鼠脾細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）對B16的特異性細(xì)胞毒作用將效應(yīng)細(xì)胞（分離的脾單核細(xì)胞）和靶細(xì)胞（滅活的B16細(xì)胞）以效靶比為20∶1混合培養(yǎng)于10%FCS RPMI 1640 培養(yǎng)液（含 IL?2 100U／L）中，4 h后用LDH釋放法檢測試劑盒檢測不同組LDH的釋放水平，CTL殺傷效率計算公式：殺傷率（%）＝OD（實(shí)驗(yàn)組?效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)?靶細(xì)胞自發(fā)）OD（靶細(xì)胞最大?靶細(xì)胞自發(fā)）×100%。

1．11 統(tǒng)計學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少兩次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 StatView （version 5．0） software（SAS Institute Inc．Cary，NC）統(tǒng)計軟件處理。計量數(shù)據(jù)以x ±s表示，組間均數(shù)比較采用ANOVA分析，統(tǒng)計學(xué)差異顯著性采用 log?rank檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 同源腫瘤細(xì)胞攻擊后小鼠出瘤情況、腫瘤生長曲線及生存期觀察的比較總觀察期為40 d，將小鼠體內(nèi)腫瘤體積繪制成動態(tài)圖（圖1）：PBS對照組腫瘤生長迅速，平均出瘤時間為（5．3±1．8） d，并在 30 d內(nèi)全部死亡（小鼠的生存周期為 20．9±2．9 d）。 相比于PBS組，CpG?ODN組、HCL組以及聯(lián)合疫苗組（HCL＋CpG?ODN）的小鼠腫瘤均受到不同程度的抑制，其中聯(lián)合疫苗組的腫瘤抑制水平最高（P＜0．05）。小鼠接瘤之后，直至觀察結(jié)束，約有35%未出瘤。已出瘤小鼠的平均出瘤天數(shù)為（11．7±5．0）d，超過 73%的小鼠在觀察結(jié)束之后仍然存活，存活時間明顯長于其他組（P＜0．01）。 CpG?ODN 組未出瘤小鼠僅為一只，出瘤小鼠的出瘤時間為（8．6±3．2）d，小鼠 40 d 的存活率為52%（14／27）。HCL組和PBS組的出瘤時間基本相同，為（5．6±1．7） d，但是在腫瘤生長抑制作用上，兩組的差別比較明顯，HCL組46%（12／26）的小鼠生存期超過了40 d，較對照組延長。CpG?ODN組相較于HCL組來說，無論是平均出瘤時間，還是生存期都有所延長。

圖1 小鼠腫瘤體積生長曲線圖

2．2免疫后小鼠外周血T細(xì)胞亞群CD4＋、CD8＋的比值升高，但CD4＋CD25＋T細(xì)胞比例無差異研究顯示機(jī)體的免疫功能狀態(tài)在很大程度上與T細(xì)胞亞群的比例有關(guān)，以流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞外周血進(jìn)行檢測，CD4＋T細(xì)胞與CD8＋T細(xì)胞比值低提示免疫功能低下，而 HCL 組、CpG?ODN 組與 HCL＋CpG?ODN 組小鼠的外周血CD4＋／CD8＋的值均較PBS組升高（P＜0．001）。 其中聯(lián)合疫苗組 CD4＋／CD8＋的值最高，與其它治療組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001）。HCL 組和 CpG?ODN 組的 CD4＋／CD8＋值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．048，圖 2）。

圖2 外周血T細(xì)胞亞群分布比例

2．3 聯(lián)合免疫小鼠脾細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子的活性顯著增加治療組IFN?γ和IL?2的水平與對照組相比，均有不同程度的提升（P＜0．05）。 其中 HCL＋CpG?ODN組的小鼠可誘導(dǎo)出最高水平的IFN?γ和IL?2，分別為（1402．5±156．5） pg／mL 和（532．9±41．8） pg／mL；CpG?ODN 組也可誘導(dǎo)出較高的 IFN?γ 和 IL?2，分別為（1021．8±136．9） pg／mL 和（395．3±20．1） pg／mL；HCL免疫組誘導(dǎo)出的IFN?γ和IL?2則相對較低，分別為（654．7±59．5） pg／mL 和（289．2±15．5） pg／mL，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05，圖 3）。

圖3 各組Th1細(xì)胞因子分泌水平比較

2．4 聯(lián)合免疫后小鼠脾CTL的細(xì)胞毒效率明顯增加對CTL細(xì)胞進(jìn)行毒效率檢測，相比于PBS組，單獨(dú)HCL起不到增強(qiáng)CTL特異性細(xì)胞毒效率的作用（P＞0．05）。 CpG?ODN 組和 HCL＋CpG?ODN 組均能明顯增強(qiáng)小鼠 CTL的細(xì)胞毒殺傷效率（P＜0．05），HCL＋CpG?ODN 組與 CpG?ODN 組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），對細(xì)胞毒殺傷效率的增強(qiáng)作用最顯著（表 1）。

表1 各組脾CTL對B16的特異性細(xì)胞毒殺傷效率比較

3 討論

熱休克蛋白相關(guān)腫瘤疫苗及免疫活性物質(zhì)CpG?ODN，在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)上，能夠在一定程度上起到互補(bǔ)的作用。本實(shí)驗(yàn)主要研究了小鼠的惡性黑色素瘤腫瘤細(xì)胞疫苗的療效，并觀察了不同疫苗配方對小鼠的抗腫瘤免疫效力的增強(qiáng)作用，通過檢測，聯(lián)合疫苗的效果最佳。聯(lián)合疫苗能使超過35%的小鼠抵抗住了B16細(xì)胞的攻擊。即使長出腫瘤的小鼠，其平均出瘤時間、生存期與其它各組相比亦有顯著性延長。本研究結(jié)果與Ito等［18］研究具有一致性，進(jìn)行HCL瘤苗治療，小鼠未能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫保護(hù)，HCL組的出瘤時間與PBS對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是在腫瘤的生長和小鼠的生存期上有一定的差異，說明HCL瘤苗有一定的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫作用，這可能與熱處理后腫瘤細(xì)胞內(nèi)形成的大量HSP?抗原肽復(fù)合物具有一定抗腫瘤免疫活性且不依賴于MHC的表達(dá)有關(guān)［20－21］。 另外，值得一提的是 CpG?ODN 與HCL聯(lián)合應(yīng)用后部分小鼠出現(xiàn)了因局部變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的皮膚潰瘍（該結(jié)果未在本文中列出），此現(xiàn)象在國內(nèi)外尚未見類似報道，具體原因還有待進(jìn)一步研究。此局部劇烈變態(tài)反應(yīng)的出現(xiàn)除了證實(shí)聯(lián)合疫苗可誘導(dǎo)極強(qiáng)的免疫反應(yīng)外，也提醒我們需改良接種方式以減輕治療的局部不良反應(yīng)。

為對抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，本實(shí)驗(yàn)還對小鼠細(xì)胞免疫狀態(tài)進(jìn)行了檢測。在小鼠體內(nèi)，CD4＋T細(xì)胞是細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過分泌 IL?2、INF?γ 等細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)；CD8＋T細(xì)胞能夠分泌物質(zhì)，抑制T細(xì)胞因子的免疫作用，對于小鼠機(jī)體而言，CD4＋／CD8＋細(xì)胞比值決定著免疫是否平衡，從側(cè)面反映出機(jī)體免疫功能狀態(tài)，當(dāng)CD4＋／CD8＋細(xì)胞比值下降，說明小鼠機(jī)體的免疫功能下降，而當(dāng)免疫功能有所恢復(fù)，小鼠的CD4＋／CD8＋細(xì)胞比值會有所上升。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)機(jī)體進(jìn)行免疫治療之后，CD4＋／CD8＋細(xì)胞比值均有明顯的上調(diào)，其中聯(lián)合疫苗組的上調(diào)最為明顯。后續(xù)IL?2、INF?γ細(xì)胞因子以及CTL細(xì)胞毒殺傷效率的檢測結(jié)果亦印證了該結(jié)果。

CD4＋CD25＋T細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中起著負(fù)調(diào)節(jié)的作用，所以也將其稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regular cell， Treg）。 有研究報道減少或清除 CD4＋CD25＋T細(xì)胞可以增強(qiáng)細(xì)胞疫苗的療效［22］，而CpG?ODN可通過TLR9損傷Treg細(xì)胞使其數(shù)目減少［23］。因此，本實(shí)驗(yàn)預(yù)期聯(lián)合免疫組小鼠CD4＋CD25＋T細(xì)胞比例會低于對照組，但結(jié)果卻顯示各實(shí)驗(yàn)組無明顯差異。迄今為止，Treg細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，Treg細(xì)胞可與細(xì)胞因子、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及不同腫瘤和免疫微環(huán)境等多種因素相互影響、相互調(diào)控有關(guān)［24］，本研究中各組小鼠Treg細(xì)胞亞群數(shù)量無明顯差異，亦反過來證實(shí)了Treg細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。下一步我們擬檢測Treg的功能狀態(tài)，探索其與CpG?ODN相互作用的可能信號通路，以期進(jìn)一步揭示CpG?ODN強(qiáng)化抗腫瘤免疫應(yīng)答的可能分子機(jī)制。

綜上所述，新型免疫佐劑CpG?ODN可顯著增強(qiáng)熱休克蛋白腫瘤疫苗的抗腫瘤免疫效應(yīng)。HCL攜帶多種腫瘤特異或者相關(guān)抗原的HSP?抗原肽復(fù)合物，在免疫佐劑CpG?ODN的協(xié)同作用下，免疫細(xì)胞因子分泌將會更強(qiáng)，改善T細(xì)胞亞群的比例，活化腫瘤免疫微環(huán)境，進(jìn)而增強(qiáng)單核細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒作用，從而抑制腫瘤生長。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為未來腫瘤疫苗的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。