， ， 王天，

(1. 山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250100; 2.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250014)

膽堿能抗炎通路是最近發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)相結(jié)合的重要的炎癥調(diào)節(jié)通路，并通過(guò)外周迷走神經(jīng)介導(dǎo)，快速、有效地調(diào)節(jié)機(jī)體局部或全身的炎癥反應(yīng)[1-2]。該抗炎通路的發(fā)現(xiàn)將有利于炎癥發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步研究，為臨床上尋求更好的炎癥治療措施提供依據(jù)。

膽堿能抗炎通路類似于炎癥反射， 并且有一套完整的反射弧， 包括感受器、 傳入神經(jīng)、 反應(yīng)中樞、 傳出神經(jīng)、 效應(yīng)器。 迷走神經(jīng)是一種復(fù)合型神經(jīng)， 既包括迷走傳入神經(jīng)， 也包括迷走傳出神經(jīng)， 在中樞與外周免疫系統(tǒng)間起著雙向信息交流的作用。 迷走復(fù)合體(dorsal vagal complex，DVC)作為炎癥反射的中樞系統(tǒng)， 主要由迷走神經(jīng)背核(dorsal motor nucleus of vagus nerve, DMV)和孤束核(nucleus tractussolitarious, NTS)組成。 DMV為迷走傳出神經(jīng)起始點(diǎn)， 司運(yùn)動(dòng)； NTS為迷走傳入神經(jīng)終止點(diǎn)， 司內(nèi)臟感覺(jué)。 NTS與DMV之間有纖維投射，位置關(guān)系緊密。Hermann等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，NTS和DMV中Fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量增加；黃健等[4]研究表明，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，迷走神經(jīng)放電頻率增大，遞質(zhì)釋放增多，因此膽堿能抗炎通路參與了炎癥反應(yīng)。目前，炎癥反應(yīng)過(guò)程中迷走神經(jīng)放電頻率與NTS和DMV中Fos陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)的相關(guān)性研究未見報(bào)道。

本文中通過(guò)制備大鼠內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)炎癥模型，比較LPS注射后對(duì)迷走神經(jīng)放電頻率和DVC神經(jīng)元Fos表達(dá)的影響，分析DMV和NTS神經(jīng)元的Fos表達(dá)與迷走神經(jīng)放電頻率的相關(guān)性，以進(jìn)一步探究DVC和迷走神經(jīng)在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用大鼠為體質(zhì)量是180～220 g、 品系為Wistar的雄性大鼠，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(魯)2003-0004。在室溫為(22±2)℃和自然光照條件下單籠飼養(yǎng)。

主要試劑包括：LPS，美國(guó)Sigma公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒，北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；正常山羊血清(NGS)，江蘇晶美生物科技有限公司；SP試劑盒和顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗Fos抗體SC-52，美國(guó)Santa Cruz生物公司。

主要儀器包括：856型冰凍切片機(jī)，美國(guó)AO Histostat Microtome公司；DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，華東電子管廠；JS-21型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；雙極性黃金電極，成都儀器廠；保溫臺(tái)，自制；雷磁PHS-3D型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BS200S型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；BL-420F型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，四川成都泰盟儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS炎癥動(dòng)物樣本的制備

實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水對(duì)照組和LPS炎癥組2組。

實(shí)驗(yàn)前，LPS組大鼠禁食24 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的烏拉坦腹腔注射(大鼠每千克體質(zhì)量注射5 g)麻醉大鼠，仰臥位固定四肢于37 ℃恒溫臺(tái)上。左右腹股溝部、左側(cè)頸部用眼科剪剪毛，酒精消毒，剪出長(zhǎng)度為1～1.5 cm的皮膚切口，分別用玻璃分針?lè)蛛x出右股靜脈(注射藥物)和左股動(dòng)脈(記錄血壓)并穿線備用[5]，后者用玻璃分針?lè)殖鲎髠?cè)迷走神經(jīng)干并穿單線備用。為了避免強(qiáng)烈的聲光和外來(lái)電磁干擾對(duì)大鼠的刺激，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在屏蔽室中進(jìn)行。神經(jīng)放電和血壓記錄信號(hào)穩(wěn)定后，股靜脈注射質(zhì)量濃度為2 g/L的LPS(大鼠每千克體質(zhì)量注射5 mg)。對(duì)照組的其他操作同LPS組，股靜脈注射等容量生理鹽水。

1.2.2 迷走神經(jīng)干放電的測(cè)定

輕提棉線將迷走神經(jīng)干置于極間距為2 mm的雙極黃金電極上[6]，電極的2個(gè)夾子分別夾住頸部?jī)蓚?cè)剪開的皮膚，神經(jīng)和電極接觸良好即可，不可過(guò)松或過(guò)緊。黃金電極另一端連接至多通道生理記錄儀記錄神經(jīng)放電，時(shí)間常數(shù)、采樣率、濾波范圍分別為0.001 s、 5 kHz/s、 100～1 000 Hz，以注射對(duì)照組和LPS組前的放電為基礎(chǔ)放電，在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄放電信號(hào)的變化，即LPS注射前以及注射后10、 30、 60、 120、 180 min。

1.2.3 股動(dòng)脈血壓的測(cè)定

分別用動(dòng)脈夾夾住分離出的股動(dòng)脈兩端，并在其上剪出一個(gè)小切口，將靜脈注射用針頭插入向心端，將針尖緩慢送至動(dòng)脈夾處，在含有針頭的血管下方繞線并打一個(gè)虛結(jié)，松開動(dòng)脈夾，繼續(xù)將針頭向前送至0.5～1 cm左右，打成死結(jié)。將另一端的壓力換能器接于多通道生理記錄儀記錄血壓變化，采樣率、濾波范圍分別設(shè)為5 kHz/s、100～1 000 Hz，最后用計(jì)算機(jī)進(jìn)行血壓信號(hào)采集并記錄和儲(chǔ)存。

1.2.4 血標(biāo)本的采集處理及TNF-α含量的測(cè)定

配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液質(zhì)量濃度分別為1 000、 500、 250、 125、 62.5、 31.3 ng/L共6個(gè)濃度梯度。標(biāo)準(zhǔn)孔各加入100 μL以上6個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，樣品孔加100 μL血清，空白孔加入物質(zhì)的量濃度為0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液作為洗滌液。標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔、空白孔各加入50 μL稀釋后的生物素抗體(按生物素抗體與水的體積比為1∶1 000進(jìn)行稀釋)，分別混勻后，封板膜封住，放于37 ℃水浴鍋中90 min，洗板4次；每個(gè)孔加入100 μL的鏈親和素辣根過(guò)氧化物酶(Streptavidin-HRP，含體積分?jǐn)?shù)為10%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)稀釋液，混勻后，封膜，放入37 ℃水浴鍋90 min，洗板4次。每個(gè)孔加入100 μL四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，于水浴鍋中37 ℃避光溫育5～30 min，每個(gè)孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)。在10 min內(nèi)利用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處光密度值。根據(jù)6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔和1個(gè)空白孔的光密度值，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，進(jìn)而求出樣品孔血清TNF-α的濃度。

1.2.5 延髓腦組織切片制備

腹腔過(guò)量注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的烏拉坦(大鼠每千克體質(zhì)量注射5 g)處死動(dòng)物，先用250 mL左右pH為7.4且物質(zhì)的量濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行心臟灌流，隨后灌入500 mL左右pH為7.4且質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛(PFA)。

腦干剝離、固定、脫水，隨后進(jìn)行腦干連續(xù)恒冷冠狀切片，切片厚度為30 μm，收集于物質(zhì)的量濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液中。

1.2.6 Fos蛋白免疫組織化學(xué)染色

腦片置于多孔板上，加入孵育液室溫孵育30 min；封閉液室溫處理30 min；加入兔抗Fos抗體在溫度為4 ℃的冰箱中孵育24 h；加入體積分?jǐn)?shù)為25%的生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG室溫孵育2 h；鏈親和素辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物(含體積分?jǐn)?shù)為10%的Triton X-100)常溫孵育60 min； 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)處理5～10 min；貼片，復(fù)染并封片；神經(jīng)元Fos顯微照相及處理，統(tǒng)計(jì)NTS和DMV陽(yáng)性神經(jīng)元在0.01 mm2面積上的個(gè)數(shù)和平均累積光密度(IOD)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)， 利用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較與組內(nèi)比較。 若顯著性檢驗(yàn)水平P<0.05， 則差異顯著；若P<0.01，則差異極顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 LPS炎癥對(duì)動(dòng)脈血壓的影響

LPS注射后對(duì)動(dòng)脈血壓的影響見圖1。由圖可知，與對(duì)照組相比，LPS炎癥組動(dòng)脈血壓變化差異不明顯(P>0.05)；LPS炎癥組內(nèi)毒素注射前及注射后各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)脈血壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 LPS炎癥對(duì)迷走神經(jīng)放電頻率的影響

LPS注射后對(duì)迷走神經(jīng)放電頻率的影響見圖2、 3。 由圖可知， 分別以注射對(duì)照和 LPS 前的放電為基礎(chǔ)放電，對(duì)照組中各時(shí)間點(diǎn)與基礎(chǔ)放電相比，未見明顯變化(P>0.05)；與其基礎(chǔ)放電相比，LPS組放電頻率明顯增大(P<0.01)；LPS組與對(duì)照組相比，注藥后各時(shí)間點(diǎn)放電頻率明顯增大(P<0.01)。由此可知，迷走神經(jīng)通過(guò)放電頻率的增大來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。

圖1 脂多糖(LPS)炎癥時(shí)動(dòng)脈血壓的變化

圖2 脂多糖(LPS)炎癥頸迷走神經(jīng)各時(shí)間段放電變化

*—P<0.05；**—P<0.01，對(duì)照組與內(nèi)毒素炎癥組；#—P<0.05；##—P<0.01，LPS注射前與注射后。

2.3 LPS炎癥對(duì)血清TNF-α水平的影響

測(cè)得LPS炎癥組血清TNF-α的質(zhì)量濃度為66.74 ng/L， 對(duì)照組血清TNF-α的質(zhì)量濃度為2.59 ng/L， 因此，相對(duì)于對(duì)照組，LPS炎癥組TNF-α的質(zhì)量濃度明顯增大，差異非常顯著(P<0.01)。

2.4 LPS炎癥對(duì)DVC神經(jīng)元Fos表達(dá)的影響

LPS炎癥對(duì)DMV和NTS神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖4。由圖可知，在DMV和NTS中Fos陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕黃色。

(a)對(duì)照組

(b)LPS組圖4 迷走神經(jīng)背核(DMV)和孤束核(NTS)中Fos蛋白表達(dá)結(jié)果(放大100倍)

注射LPS后，DVC中NTS和DMV神經(jīng)元Fos表達(dá)統(tǒng)計(jì)比較結(jié)果見圖5。由圖可知，與對(duì)照組相比，LPS組Fos陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量在NTS和DMV均顯著增多(P<0.01或P<0.05)；同時(shí)DMV和NTS的Fos陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)的強(qiáng)度(AIOD)也均有極顯著增強(qiáng)(P<0.01)。由此推斷，在LPS大鼠炎癥模型中，DVC中的核團(tuán)NTS和DMV參與了炎癥反應(yīng)。

3 討論

LPS是多種革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，對(duì)宿主有毒性，能夠引起機(jī)體免疫刺激的級(jí)聯(lián)反應(yīng)和機(jī)體的毒性病理生理活動(dòng)，因此可作為強(qiáng)炎癥誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等的合成與分泌，誘導(dǎo)疾病研究的動(dòng)物模型如炎癥反應(yīng)，急性肺損傷等[7]。

在LPS炎癥模型反應(yīng)中， 刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子， 并進(jìn)一步誘導(dǎo)各臟器的損傷， 其中TNF-α是誘導(dǎo)組織損傷的最關(guān)鍵細(xì)胞因子。TNF-α在炎癥反應(yīng)中作為關(guān)鍵啟動(dòng)因子，與疾病發(fā)生程度有明顯的相關(guān)性[8]。研究[9]表明，大鼠靜脈滴注LPS，TNF-α水平明顯升高，平均動(dòng)脈血壓很快下降并出現(xiàn)休克。與本實(shí)驗(yàn)靜脈注射LPS后， TNF-α水平比對(duì)照組的顯著升高，動(dòng)脈血壓降低的結(jié)果相一致。

(a)神經(jīng)元Fos表達(dá)

(b)平均光密度*—P<0.05；**—P<0.01，對(duì)照組與內(nèi)毒素炎癥組；DMV—迷走神經(jīng)背核；NTS—孤束核。

研究[10-14]表明，免疫系統(tǒng)不僅受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，還受迷走神經(jīng)重要的調(diào)控作用，已成為近幾年的研究熱點(diǎn)。迷走神經(jīng)可以直接把外周的炎癥性刺激傳到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如把膈下迷走神經(jīng)切斷，可阻斷由腹腔注射IL-1引起的發(fā)熱反應(yīng)[15]。另外，注射LPS所引起的大鼠發(fā)熱可通過(guò)切斷膈下迷走神經(jīng)而得到緩解，同時(shí)室旁核神經(jīng)元放電頻率減小[16]。本文中的研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射LPS后，迷走神經(jīng)的放電頻率比對(duì)照組的明顯增大，進(jìn)而可推測(cè)通過(guò)迷走傳入神經(jīng)向中樞傳遞的信息增多，或迷走傳出神經(jīng)從中樞向外周傳遞的沖動(dòng)增加，說(shuō)明迷走神經(jīng)直接參與了炎癥信息的傳遞。最新研究[17-18]表明，頸迷走神經(jīng)刺激可顯著抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，迷走神經(jīng)電刺激可活化膽堿能抗炎通路對(duì)LPS血癥小鼠腸道上皮和肺的血?dú)馄琳系耐ㄍ感缘谋Ｗo(hù)作用。Thomas等[19]通過(guò)缺血再灌注損傷引起的TNF-α增加可通過(guò)電生理刺激迷走神經(jīng)來(lái)減少，從而緩解缺血再灌注引起的休克。黃健等[4]發(fā)現(xiàn)，夾傷迷走神經(jīng)干外周端或中樞端并注射LPS后，迷走神經(jīng)傳入或傳出纖維放電頻率明顯增大，均表明迷走神經(jīng)參與了機(jī)體的抗炎癥反應(yīng)。

在注射LPS后，可引起下丘腦室旁核和視上核Fos表達(dá)增加，而且室旁核隨著注射LPS劑量的增加Fos陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)顯著增強(qiáng)[20-23]。Hermann等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，NTS和DMV中Fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量增加與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明迷走神經(jīng)放電頻率增大向中樞傳遞的沖動(dòng)增多或中樞興奮性增加向外周傳遞信息增多，引起中樞DVC中核團(tuán)NTS和DMV的Fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量增加，進(jìn)而對(duì)膽堿能抗炎癥通路的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本文中通過(guò)制備大鼠LPS炎癥模型，在迷走神經(jīng)放電和DVC神經(jīng)元Fos表達(dá)關(guān)聯(lián)的基礎(chǔ)上，比較LPS注射后對(duì)迷走神經(jīng)放電頻率和DVC神經(jīng)元Fos表達(dá)的影響。結(jié)果表明，在炎癥反應(yīng)中，迷走神經(jīng)放電頻率增大，NTS和DMV的Fos蛋白表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明迷走神經(jīng)可能參與了膽堿能抗炎通路，NTS和DMV可能為膽堿能抗炎通路的低位中樞，通過(guò)迷走傳入神經(jīng)纖維完成對(duì)外周信息的接受、處理和整合并將產(chǎn)生的沖動(dòng)經(jīng)迷走傳出神經(jīng)纖維調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。

迷走神經(jīng)是復(fù)合神經(jīng)，在炎癥反應(yīng)中是迷走傳入神經(jīng)纖維放電頻率增加還是迷走傳出神經(jīng)纖維放電頻率增加的問(wèn)題值得進(jìn)一步研究和探討。